분자 반전 프로브

Molecular Inversion Probe

MIP([1]Molecular Inversion Probe)는 게놈의 [2]특정 영역을 포착하고 풍부하게 하는 프로세스인 게놈 분할을 수행하기 위한 순환화에 의한 포획(Capture by Circulization)의 종류에[1] 속합니다.이 기술에 사용되는 프로브는 단일 가닥 DNA 분자로, 다른 게놈 분할 기술과 유사하게 게놈의 표적에 상보적인 배열을 포함합니다. 이러한 프로브는 게놈 표적에 교배하여 표적을 포착합니다.MIP는 MIP 프로브가 링커 영역으로 분리된 2개의 게놈 타깃 보완 세그먼트의 공통 설계를 공유한다는 점에서 다른 게놈 분할 전략과는 다르다.이 설계에서는 프로브가 타겟에 하이브리드 되면 (기술의 이름으로 제시된) 구성의 반전을 거쳐 순환합니다.구체적으로는 프로브의 5' 및 3' 단부에 있는 2개의 타깃 상보 영역이 서로 인접하고 내부 링커 영역은 자유 리프팅 루프를 형성한다.이 기술은 HapMap 프로젝트에서[3] 대규모 SNP 유전자형성뿐만 아니라 암과 같은 다양한 질병의 바이오마커를 식별하기 위해 유전자 복제 변화와[4] 특정 유전자 위치의[2][5] 특성을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다.MIP 기술의 주요 강점은 타겟에 대한 높은 특이성과 수만 개의 게놈 위치를 동시에 검사하는 높은 스루풋 다중 분석을 위한 확장성입니다.

테크닉 순서

전형적인 분자 반전 프로브의 특징
분자 반전 프로브를 이용한 게놈 영역 포착 절차

분자 반전 프로브 구조

탐침은 게놈 표적을 보완하는 염기서열을 5'[2][3][6]와 3' 끝에 두고 설계된다.내부 영역에는 모든 MIP에 공통인 두 개의 범용 PCR 프라이머 사이트와 일반적으로 제한 [3]부위인 프로브 릴리스 사이트가 있습니다.포착된 게놈 타깃의 식별이 어레이 기반의 하이브리드화 어프로치를 사용하여 이루어지는 경우 내부영역은 주어진 프로브를 일의로 식별하는 프로브 특이 태그 시퀀스와 더불어 프로브 해제 사이트와 마찬가지로 제한 사이트인 태그 해제 사이트를 선택적으로 포함할 수 있다.

프로토콜

  • 게놈 표적 DNA에 대한 아닐 프로브

프로브는 게놈 DNA 샘플에 첨가된다.소둔 공정 후에 변성 후 프로브의 표적-보완단을 표적 DNA에 하이브리드화한다.그런 다음 이 프로세스에서 프로브는 원형화를 거칩니다.단, 이들 프로브는 프로브의 하이브리드화된 끝에 의해 구분된 갭이 타깃 영역 위에 유지되도록 설계되어 있습니다.간극의 크기는 SNP 유전자형을 위한 단일 뉴클레오티드에서 위치 포획을 위한 수백 개의 뉴클레오티드에 이른다(예: 엑솜 포획).[5]

  • 갭 메우기

그 틈은 유리 뉴클레오티드를 사용하는 DNA 중합효소에 의해 채워지고 프로브 끝은 연결효소에 의해 결합되어 완전히 원형화된 프로브가 된다.

  • 반응하지 않는 프로브 제거

반응하지 않은 프로브에 대해서는 간격 채우기가 수행되지 않으므로 간격 채우기는 선형으로 유지됩니다.엑소핵산가수분해효소 처리는 이러한 비반응 프로브와 반응에서 남아 있는 선형 DNA를 제거한다.

  • 프로브 릴리스

프로토콜의 일부 버전에서 프로브 해제 부위(일반적으로 제한 부위)는 프로브가 선형화되도록 제한 효소에 의해 분할된다.이 선형화된 프로브에서 범용 PCR 프라이머 배열은 5' 및 3' 끝에 위치하고 포착된 게놈 타깃은 프로브의 내부 세그먼트의 일부가 된다.다른 프로토콜은 탐침을 원형 분자로 남깁니다.

  • 캡처된 목표치

프로브가 선형화되면 기존의 PCR 증폭이 실행되어 프로브의 유니버설프라이머를 사용하여 포착된 타깃을 농축한다.그렇지 않으면 원형 프로브에 대해 롤링 서클 증폭이 수행됩니다.

  • 캡처된 타깃 식별

캡처된 타깃은 어레이 기반 하이브리드 접근법 또는 [5]타깃 시퀀스를 통해 식별할 수 있습니다.어레이 베이스의 어프로치를 사용하는 경우, 프로브에 의해서 타겟이 되는 게놈 영역과 프로브를 일의로 식별하는 프로브 고유의 태그를 선택적으로 포함할 수 있습니다.각 프로브의 태그는 태그 해제 부위를 제한 효소로 절단하여 해방됩니다.그런 다음 이러한 태그는 배열에 배치되어 서로 보완하는 시퀀스에 하이브리드됩니다.캡처된 표적은 프로브를 시퀀싱하여 식별할 수도 있으며, 이제 표적이 포함됩니다.SOLiD, Illumina 또는 Roche 454와 같은 기존의 Sanger 시퀀싱 또는 보다 저렴한 스루풋 기술을 이 용도로 사용할 수 있습니다.

다중 분석
각 프로브가 하나의 특정 게놈 궤적을 검사하지만 여러 프로브를 하나의 튜브에 결합하여 여러 개의 궤적을 동시에 검사하는 다중 검사를 수행할 수 있습니다.현재 다중 MIP 분석에서는 단일 [2]검사에서 55,000개 이상의 Loci를 검사할 수 있습니다.

기술 개발 이력

자물쇠 프로브, 분자 반전 프로브 및 커넥터 반전 프로브의 개요

자물쇠 프로브

분자반전프로브(MIP)의 설계는 1994년 [7]닐슨 등이 최초로 보고한 분자생물학 기술인 자물쇠프로브에서 유래했다.MIP와 마찬가지로 자물쇠프로브는 40-뉴클레오티드 긴 링커 시퀀스에 의해 연결된 표적에 상보적인 두 개의 20-뉴클레오티드 긴 세그먼트를 가진 단일 가닥 DNA 분자이다.표적 상보 영역이 DNA 표적과 교배되면 자물쇠 프로브도 원형화된다.그러나 MIP와 달리 패드락 프로브는 하이브리드 시 타깃 보완 영역이 타깃 영역 전체에 걸쳐 공백이 없도록 설계되어 있습니다.따라서 자물쇠 프로브는 이미 알려진 염기서열을 가진 DNA 분자를 검출하는 데에만 유용합니다.

닐슨 [7]외 연구진은 합성 올리고뉴클레오티드 및 원형 게놈 클론을 포함한 수많은 DNA 표적을 검출하기 위해 자물쇠 프로브를 사용하는 것을 시연했다.자물쇠 탐침은 표적에 대한 특이성이 높고 서로 흡사한 표적 분자를 구별할 수 있다.닐슨 외 [7]연구진은 또한 정상 낭포성 섬유화 전도성 수용체(CFCR)와 돌연변이 낭포성 섬유화 전도성 수용체(CFCR)를 구별하기 위해 자물쇠 프로브를 사용하는 것을 시연했다.결찰은 타겟에 혼성될 때 프로브의 양끝이 서로 바로 인접해야 하므로 돌연변이에서의 3bp 결실은 성공적인 결찰을 방해했다.패드락 프로브는 또한 전이 상태의 염색체 샘플에서 12번 염색체에 특정한 알파벳 반복을 검출하기 위해 현장 교배에도 성공적으로 사용되었다.여기서, 전통적인 선형 올리고뉴클레오티드 탐침은 결과를 [7]도출하지 못했다.따라서 자물쇠 프로브는 [7]게놈에서 단일 복사 요소를 검출하기에 충분한 특이성을 가지고 있습니다.

분자 반전 프로브

SNP 유전자형을 실시하기 위해 Hardenbol 등은 [3]프로브가 게놈 타겟에 하이브리드 되었을 때 SNP 위치에 틈이 생기도록 패드록 프로브를 수정했다.SNP 위치에서 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드를 사용한 갭 충전은 다형성의 동일성을 결정한다.이 설계는 기존의 자물쇠 프로브 기술에 비해 많은 이점을 가져옵니다.그럴듯한 SNP에 고유한 여러 개의 자물쇠 프로브를 사용하려면 특정 궤적에서의 SNP 카운트가 적절히 [3]정규화되도록 하기 위해 이들 대립유전자 고유의 프로브의 농도를 신중하게 균형 있게 조정해야 합니다.또한 이 설계에서는 불량 탐침이 특정 궤적의 모든 유전자형에 [3]균등하게 영향을 미칩니다.예를 들어 MIP 프로브는 특정 게놈 궤적에서 여러 유전자형을 측정할 수 있기 때문에 특정 궤적에 대한 프로브가 작동하지 않는 경우(예를 들어 게놈 표적에 대한 적절한 교배 실패), 이 궤적에 있는 유전자형은 검출되지 않습니다.이와는 대조적으로 자물쇠 프로브의 경우 각각의 유전자형을 특정 궤적을 검출하기 위해 별도의 자물쇠 프로브를 설계해야 한다(예를 들어 특정 SNP 궤적에서 "A"를 검출하기 위해서는 하나의 자물쇠 프로브가 필요하며, 그 궤적에서 "T"를 검출하기 위해서는 다른 자물쇠 프로브가 필요하다).따라서 잘못된 자물쇠 프로브는 프로브가 검출하도록 설계된 특정 유전자형 검출에만 영향을 미치는 반면, 잘못된 MIP 프로브는 궤적의 모든 유전자형에 영향을 미칩니다.MIP를 사용하면 소정의 궤적을 평가하도록 설계된 프로브가 동작하지 않으면 이 궤적의 데이터가 생성되지 않고 SNP 콜이 실행되지 않기 때문에 잘못된 SNP 콜이 발생할 수 있습니다.

그들의 절차에서 Hardenbol 외 [3]연구진은 단일 튜브에서 1000개 이상의 SNP 위치를 동시에 측정했으며, 튜브에는 별개의 설계의 프로브가 1000개 이상 들어 있었다.프로브 풀은 4개의 다른 반응을 위해 4개의 튜브로 분류되었다.각 반응에서 갭 채우기에 별개의 뉴클레오티드(A, T, C 또는 G)가 사용되었다.SNP 궤적의 뉴클레오티드가 적용된 뉴클레오티드와 상보적인 경우에만 결찰에 의해 갭이 닫히고 프로브가 원형화된다.포착된 SNP의 식별은 유전자형 배열에서 수행되었으며, 배열 상의 각 스팟은 프로브의 궤적 고유 태그를 보완하는 시퀀스를 포함하고 있었다.DNA 어레이 비용은 이 기술의 비용에 크게 기여하기 때문에 4칩 원컬러 검출의 성능을 2칩 2컬러 검출과 비교했습니다.결과는 SNP 콜 레이트 및 신호 대 잡음 [3]비 측면에서 유사한 것으로 나타났습니다.

최근 보고서에서 [6]이 그룹은 12,000개의 개별 프로브를 사용하여 10,000개 이상의 SNP 위치를 동시에 측정하기 위해 다중화 수준을 성공적으로 증가시켰습니다.연구는 30개의 트리오 표본(각 트리오는 엄마, 아빠 및 자녀로 구성됨)에서 SNP 다형을 조사했습니다.부모의 유전자형을 알고, 자녀에게 예측된 SNP 유전자형의 정확성은 예상되는 멘델 유전 패턴과 예측된 유전자형 사이에 일치성이 존재하는지 여부를 조사함으로써 결정되었다.트리오 일치율은 99.6%[1]를 넘는 것으로 나타났습니다.또한 MIP 고유의 퍼포먼스 메트릭스 세트가 개발되었습니다.이 작업은 HapMap [6]프로젝트에서 높은 처리량 SNP 유전자형을 위한 프레임워크를 설정했습니다.

커넥터 반전 프로브

단일 뉴클레오티드보다 긴 게놈 영역을 포착하기 위해 Akhras [5]등은 하이브리드 프로브 끝에 의해 구분된 갭을 확장하여 MIP의 설계를 수정하고 설계 이름을 Connector Inversion Probe(CIP)로 지었다.격차는 캡처할 게놈 관심 영역(예: 엑손)에 해당한다.4개의 뉴클레오티드를 모두 사용하여 DNA 중합효소로 갭 충전 반응을 달성합니다.포착된 영역의 식별은 프로브의 목표 상보적 끝 중 하나에 매핑되는 궤적 고유의 프라이머를 사용하여 이들 영역을 시퀀싱함으로써 수행할 수 있습니다.

Akhras [5]등은 또한 시약 비용을 낮추기 위해 다중 다중 자물쇠(MMP) 바코드 시스템을 개발했다.단일 분석에는 여러 개인의 DNA 샘플이 포함될 수 있으며 각 개인의 여러 게놈 위치를 검사할 수 있습니다.개별 및 게놈 궤적의 그럴듯한 조합을 고유하게 식별하는 DNA 바코드 시스템은 프로브의 링커 영역에 삽입된 DNA 태그로 나타난다.따라서 캡처 영역의 시퀀스에는 바코드가 포함되어 있어 캡처 영역이 속한 개체와 게놈 궤적을 모호하지 않게 결정할 수 있다.

이 그룹은 궤적 고유의 CIP(CIP creator 1.0.1)를 설계하기 위한 소프트웨어도 개발했습니다.

어플

MIP(Molecular Inversion Probe)는 추가 검사를 위해 게놈의 작은 영역을 포착하는 데 널리 사용되는 기술 중 하나입니다.차세대 염기서열 분석 기술의 발명으로 전체 게놈의 염기서열 분석 비용은 크게 줄었지만, 모든 실험실에서 실제로 사용하기에는 비용이 너무 높다.대신, 다른 게놈 분할 기술을 사용하여 게놈의 작지만 매우 구체적인 영역을 분리하여 추가 분석을 할 수 있습니다.예를 들어 MIP는 SNP 유전자형, 복사 번호 변형 또는 대립 유전자 불균형 연구의 대상을 포착하는 데 사용할 수 있습니다.

SNP 유전자형

SNP 유전자형성에서는 프로브를 4개의 반응으로 분리하여 각각 다른 유형의 뉴클레오티드를 첨가한다.표적 영역의 SNP가 첨가된 뉴클레오티드에 상보적인 경우 결찰에 성공하여 프로브가 완전히 원형화된다.각 탐침은 게놈에서 정확히 하나의 SNP 표적과 교배하기 때문에, 성공적으로 원형화된 탐침은 SNP의 뉴클레오티드 식별성을 제공합니다.4개의 뉴클레오티드 특이적 반응에서 나온 태그 배열은 4개의 유전자형 배열 또는 2개의 이중 색상 배열(각 반응에 대해 하나의 채널)로 교배된다.어레이상의 어느 스팟이 태그에 의해서 바인드 되고 있는지를 분석하면, 이러한 태그에 의해서 나타나는 게놈 위치에서의 SNP ID를 판별할 수 있습니다.

MIP에 의해 표적이 된 SNP는 양적 특성 위치(QTL) 분석이나 게놈 전체 연관 연구(GWAS)와 같은 연구 영역에서 사용될 수 있으며, SNP는 간접 연계 불균형 연구 또는 원인 돌연변이에 대해 직접 선별된다.

복사 번호 변동 검출

Copy Number Variation(CNV; 복사 번호 변동) 검출에도 분자 반전 프로브 기술을 사용할 수 있습니다.MIP의 CNV 분석뿐만 아니라 SNP 유전자형 분석에서도 이러한 이중 역할은 최근 CNV 검출 및 분석에 사용되고 있는 고밀도 SNP 유전자형 배열과 유사합니다.이러한 기술은 유전자형 데이터에서 대립 유전자 특이적 신호 강도를 추출하여 CNV 결과를 생성하는 데 사용합니다.이러한 기술은 G-밴드 핵형 분석, FISH(Fluorence in sit hybridization) 또는 어레이 비교 게놈 하이브리드(aCGH)와 같은 기존 기술보다 정밀도와 분해능이 높다.

현재의 조사

MIP는 많은 연구 분야에서 광범위하게 사용되어 왔습니다.최근 문헌에서 이 기법을 사용한 예는 다음과 같습니다.

  • 분자 반전 프로브 기술은 소아 암의 가장 일반적인 고형 소아암이자 소아암 사망률의 주요 원인인 소아 뇌종양을 연구하는 데 사용되어 왔다.높은 발병률에도 불구하고 소아교종의 발생과 진행에 기여하는 유전적 사건에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.MIP는 최소 DNA를 사용하여 이 암에서 카피 넘버 사건의 새로운 영역을 확인했습니다.이러한 사건의 식별은 이 [8]질병의 근본적인 메커니즘에 대한 이해로 이어질 수 있다.
  • 45개의 소아 백혈병 검체를 분자 반전 프로브 기술을 사용하여 유전자 복제 이상에 대해 분석하였다.MIP 분석에서는 69개의 반복적인 복사 번호 변경 영역이 확인되었으며, 이 중 41개는 다른 DNA 마이크로 어레이 플랫폼에서는 식별되지 않았습니다.이용 가능한 임상핵형의 98%와 [9]현장 혼성 연구의 100%에서 복사 번호 이득과 손실이 검증되었다.
  • 또 다른 연구에서 MIP는 카스파아제-3, 카스파아제-7, 카스파아제-8 유전자의 다형성과 하플로타입 사이의 연관성과 자궁내막암의 [10]위험을 식별하기 위해 사용되었다.
  • 최근 연구에 따르면 포르말린 고정 파라핀 내장 샘플의 복사 번호 변동 및 유전자형식 연구에 대한 MIP의 성공이 입증되었습니다.일반적으로 광범위한 추적 정보가 포함된 이러한 뱅크 샘플은 고정 및 처리 중 DNA 분해 및 가교로 인해 새로 냉동된 샘플에 비해 성능이 떨어지거나 높은 실패율을 겪습니다.그러나 이번 연구는 MIP를 적용하여 포르말린 고정 파라핀 내장 [11]검체로부터 고품질 복사 번호와 유전자형 데이터를 얻는 데 성공했다.
  • 분자 반전 프로브 기술은 약제유전체학 분야에서도 사용되어 왔다.MIP를 이용한 약물 대사, 배설 및 운반에 중요한 유전자의 유전자형은 [12]약물에 대한 반응의 환자 간 차이를 이해하는 길을 열어주었다.

MIP 설계 및 최적화

프로브 설계 최적화 전략

캡처된 영역의 다중화 정도와 길이를 최적화하려면 [2]프로브를 설계할 때 다음과 같은 여러 요소를 고려해야 합니다.

  • DNA 표적을 보완하는 탐침의 배열은 구체적이고 게놈에서 합리적인 배열 복잡성을 가진 독특한 영역에만 매핑되어야 합니다.반복치료가 포함된 게놈 영역은 주의하여 취급해야 합니다.
  • 단일 분석에 사용되는 모든 프로브에 대해 프로브의 두 대상 상보적 단부의 아닐링 온도는 동일한 [3]온도에서 두 단부의 목표물과 교배할 수 있도록 유사해야 합니다.
  • 게놈 목표물의 GC 함량은 유사해야 하며 모든 갭이 유사한 신장 시간 [2]범위 내에서 채워질 수 있도록 목표 길이 가변성을 제한해야 한다.
  • 게놈 타겟의 길이는 너무 길 수 없습니다(현재 성공한 어플리케이션의 타겟[2] 길이는 100~200bp입니다).그렇지 않으면 스테릭 효과가 [2]타겟에 대한 프로브의 성공적인 하이브리드화를 방해할 수 있습니다.
  • 마이크로 어레이 기반 캡처 영역 식별에 사용되는 각 프로브의 태그는 용해 온도와 최대 직교 기저 복잡도를 가져야 합니다.이를 통해 모든 태그를 동일한 조건에서 어레이에 하이브리드화할 수 있으며 교차 하이브리드화가 각각 최소화됩니다.

MIP 프로토콜 최적화 전략

최적화를 [2]위해 다음과 같은 여러 실험 조건을 수정할 수 있습니다.

  • 하이브리드화 및 갭 메우기 시간
  • 프로브, 리가아제 및 DNA 중합효소 농도
  • 모든 프로브에 공통되는 범용 프라이머를 사용하여 멀티템플릿 PCR을 수행하기 위해 원 증폭 또는 프로브 선형화를 통해 포착된 타깃의 농축
  • 어레이 기반의 하이브리드화 접근법 또는 타깃의 직접 시퀀싱을 통해 타깃 식별을 캡처

한 연구에서는 적절한 최적화 전략을 통해 목표 포착 효율성이 18%에서 91%[13]로 증가했기 때문에 이러한 요인이 매우 중요합니다.

퍼포먼스 지표

터너 등2009년에는[2] 시퀀싱으로 대상을 식별하는 MIP 기반 게놈 캡처 실험에서 일반적으로 보고되는 두 가지 지표를 요약했다.

  • 균일성 포착: 리콜과 유사– 자신 있게 포착된 게놈 타깃의 비율.특히, 각 게놈 표적에 매핑된 시퀀스 판독의 상대적 풍부함.
  • 캡처의 특이성: 정밀도와 유사– 실제로 관심 있는 게놈 타깃에 매핑되는 시퀀스 판독의 비율.

이들 2개의 메트릭은 프로브 배치의 품질에 직접적인 영향을 받습니다.저품질 프로브에 대한 결과를 개선하기 위해 더 높은 수준의 시퀀싱 깊이를 수행할 수 있습니다.균일성과 특수성이 감소함에 따라 시퀀싱 척도가 거의 기하급수적으로 증가합니다.

Hardenbol et al. 2005는[6] MIP를 사용한 SNP 유전자형과 관련된 일련의 지표를 제안했다.

  • 단일/소음비:백그라운드 카운트에 대한 실제 유전자형 카운트의 비율
  • 프로브 변환 속도:프로브를 설계하고 성공적으로 검사할 수 있는 게놈 SNP 위치 수.즉, 이 메트릭은 유전자형성 결과를 생성하는 프로브의 비율에 관한 것입니다.
  • 콜 레이트:특정 SNP 궤적에 대해 이 궤적에 유전자형이 있는 DNA 샘플의 수를 측정할 수 있습니다.즉, 주어진 SNP 궤적에 할당된 유전자형에 대한 뒷받침 증거의 수.
  • 완전성:SNPs 분석 세트의 경우 성공적으로 얻은 유전자형의 총 비율입니다.
  • 정확도:분석된 SNP 세트의 경우, 분율이 올바른 유전자형을 검출했습니다.이는 일반적으로 결과의 반복성으로 측정됩니다.

프로브 변환률과 정확도 사이에는 고유의 트레이드오프가 존재합니다.잘못된 유전자형이 검출된 프로브를 제거하면 정확도는 향상되지만 프로브 변환 속도는 감소합니다.이와는 대조적으로 관대한 프로브 허용 임계값을 사용하면 프로브 변환 속도는 [6]증가하지만 정확도는 감소합니다.

기타 게놈 분할 기법

다양한 Genomic 파티션 기술의 개요

전체 게놈 배열에 따른 비용을 줄이기 위해 특정 게놈 영역을 풍부하게 하는 많은 방법이 제안되어 왔다.

기술. 세부 사항 멀티플렉스a 레벨
멀티플렉스[14] PCR 다중 표적 특이 프라이머 세트를 사용하여 게놈 표적을 PCR 증폭하여 표적 농축 102 ~ 103
회람에[3][5][6][15][16] 의한 캡처 타깃을 보완하는 시퀀스를 포함하는 프로브를 사용한 타깃 캡처
프로브를 타겟에 혼성시키면 제품이 원형화된다.
롤링 서클 증폭 또는 범용 프라이머를 사용한 PCR을 통한 목표 농축 		104 ~ 105
솔루션 기반[17] 캡처 유전체 DNA 산탄총 조각은 바이오티닐화 탐침에 의해 포착되어
원하는 대상을 보완하는 시퀀스		 104 ~ 105
어레이 기반[18] 캡처 원하는 표적을 보완하는 염기서열을 가진 스팟을 포함하는 마이크로어레이에서 포착된 게놈 DNA 샷건 조각
 105 ~ 106
a한 번의 실행으로 측정할 수 있는 게놈 위치 수

순환화 방식에 의한 기타 캡처

유전자 선택 방법:[15]관심 대상을 풍부하게 하기 위해 초기 다중 PCR 스텝이 실행된다.PCR 제품은 PCR 단계에서 사용되는 2개의 프라이머를 보완하는 시퀀스를 가진 타깃 고유 프로브에 대한 하이브리드화 시 원형화됩니다.

선택적 원형화 [16]방법으로 캡처:게놈 DNA는 제한 효소에 의해 조각으로 소화된다.관심 대상을 보완하는 측면 영역을 가진 선택기 프로브를 사용하여, 소화된 DNA 조각은 선택기 프로브에 대한 교배 시 원형화된다.

게놈 분할 기법 간의 퍼포먼스 비교

각 방법은 통일성, 캡처의 특정성, 비용, 확장성 및 가용성 간의 균형을 보여줍니다.

  • 캡처의 특수성 측면에서는 순환화에 의한 캡처 방법이 최상의 결과를 보여줍니다.이는 이 클래스의 모든 방법이 성공적인 결속을 위해 단일 동족 파트너 분자(예: 게놈 표적 영역)에 동시에 결합하기 위해 동일한 DNA 분자의 두 끝(예: MIP 프로브의 두 끝)을 필요로 하기 때문이다.
  • 반면 순환화에 의한 캡처 방법은 다른 방법에 비해 균일성이 떨어집니다.이는 각 개별 게놈 표적에 대한 프로브 설계가 고유하기 때문에 개별 프로브 간의 성능이 다를 수 있기 때문입니다.
  • scalability에 관해서는 순환화에 의한 캡처와 솔루션 기반의 캡처 방법의 특수성이 높기 때문에 다수의 게놈 타깃과 샘플이 관련된 연구에 가장 적합합니다.어레이 기반 캡처 기술은 많은 게놈 타깃을 연구하는데 적합하지만 마이크로 어레이의 분해능과 특수성이 제한되기 때문에 샘플 수가 적습니다.다중 PCR 방법은 사용 편의성과 시약의 가용성 때문에 소규모 스터디에 가장 적합합니다.
  • 각 기법과 관련된 비용은 설계와 실험 조건의 광범위한 선택권을 고려할 때 비교하기 어렵다.단, 모든 기술에 대해 동시에 다수의 로케이를 측정하는 높은 다중화 수준을 달성하면 비용이 상각된다.

MIP의 장점

  • 다른 유전자형성 기법의 일부와 달리, MIP 적용 전에 PCR을 통해 DNA 샘플을 증폭시킬 필요가 없어진다.이는 프라이머 쌍 간에 크로스톡이 발생할 가능성이[3] 높은 많은 대상 시퀀스를 동시에 검사할 때 유용합니다.
  • 고특이성:이를 통해 높은 특이성을 달성할 수 있습니다.
    i) 다른 고다중 유전자형 기술과는 달리 MIP는 용액 중 효소적 단계(DNA 중합 및 결찰)를 이용하여 특이적 위치를 포착한 후 증폭 단계를 수행한다.이러한 효소 단계의 조합은 MIP 분석에[19] 높은 수준의 특이성을 부여합니다.
    ii) 핵산가수분해효소 처리로 비반응 선형 프로브 제거
    iii) 잡종 시 특이성을 높이고 검출 단계에서[3] 크로스톡을 방지하도록 태그 시퀀스를 선택한다.
    iv) 탐촉자의 양 끝에 있는 표적 상보적 배열은 물리적으로 국소적으로 상호 작용하도록[3] 제한된다.
  • 신호 대 잡음 비율의 내장 품질 제어: MIP 기술은 각 SNP 위치에 대해 4개의 베이스가 모두 존재하는지 여부를 조사합니다.호모 접합 SNP는 단일 신호를 가지며 헤테로 접합 SNP는 2개의 신호를 가질 것으로 예상된다.따라서 신호 대 잡음비는 백그라운드알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레알레[3]
  • 높은 수준의 다중화(한 번의 검사에서 10-10개의45 프로브)를 달성할[2] 수 있습니다.
  • MIP 프로브를 산탄총 라이브러리 대신 게놈 DNA에 직접 적용할 수 있으므로 샘플 DNA의 양이 적다(예: 0.2ng/SNP[3]).
  • 높은 일치도: 트리오 일치율이 99.6을 넘는 것으로 확인되었습니다.%[1]
  • 재현성: 동일한 개인을 여러 번 유전자형 SNP가 일치하는 것으로 나타났다(99.9%)[3]
  • 높은 동적 범위: CNV 검출 연구에서 게놈에서[19] 최대 60개의 증폭된 영역을 검출할 수 있습니다.
  • MIP는 40쌍의 온전한 게놈 DNA를 필요로 하기 때문에 포름알데히드 고정 파라핀 내장 시료와 같은 분해 시료에 사용하면 뚜렷한 이점을[19] 제공할 수 있다.
  • 간단한 인프라(일반적인 벤치탑 시약과 도구만 필요)와 단순한 설계로 많은 실험실에서 이 기술을 폭넓게 적용할 수 있습니다.
  • 캡처된 타깃을 식별하기 위한 플랫폼의 선택은 매우 유연하기 때문에 비용 효율이 향상됩니다.예를 들어, 캡처된 타겟은 라이브러리 구성의 시퀀싱을 생략하고 직접 시퀀싱할 수 있습니다.

MIP의 제한

  • 여러 프로브가 포함된 높은 처리량 실행을 위해 동일한 실험 조건에서 모든 대상을 캡처할 수 있는 것은 아니기 때문에 다른 게놈 캡처 기술에 비해 민감도와 균일성이 상대적으로 낮다.그러나 링커 영역이 긴 프로브를 사용한 최근 연구에서는 [20]균일성이 향상되었습니다.
  • 캡처할 수 있는 목표물의 적절한 크기는 다음과 같이 제한됩니다.
    i) 갭 영역이 크면 탐촉자의 분자 내 원형화를 위한 입체적[2] 구속조건이 발생한다.
    ii) 갭이 크면 더 긴 프로브를 합성해야 하므로 비용이 증가합니다.
  • 다중화의 정도는 대상 식별을 위해 선택한 방법의 다중화 기능에 의해 제한됩니다.어레이 기반 검출 방법을 사용하는 경우, 측정 가능한 타겟의 수는 어레이의 사용 가능한 위치에 따라 제한됩니다.
  • 각 영역을 캡처하려면 별도의 프로브가 필요하므로 많은 영역을 검사하는 데 비용이 많이 듭니다.그러나 다중화를 사용하면 비용이 상각됩니다.예를 들어, 다중성 수준 1000에서는 [3]각 검사마다 프로브당 비용이 0.01달러가 됩니다.
  • MIP 반응 조건은 최적화가 필요할 수 있으며, 이는 헤테로 접합 [13]부위를 분석하는 데 특히 중요합니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ a b c d Absalan, Farnaz; Mostafa Ronaghi (2008). Molecular Inversion Probe Assay. Methods in Molecular Biology. Vol. 396. Humana Press. pp. 315–330. doi:10.1007/978-1-59745-515-2. ISBN 978-1-934115-37-4. S2CID 3690014.
  2. ^ a b c d e f g h i j k l Turner EH, Ng SB, Nickerson DA, Shendure J (2009). "Methods for genomic partitioning". Annu Rev Genom Hum Genet. 10: 263–284. doi:10.1146/annurev-genom-082908-150112. PMID 19630561. S2CID 31596835.
  3. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s Hardenbol P, Banér J, Jain M, Nilsson M, Namsaraev EA, Karlin-Neumann GA, Fakhrai-Rad H, Ronaghi M, Willis TD, Landegren U, Davis RW (2003). "Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes". Nat Biotechnol. 21 (6): 673–678. doi:10.1038/nbt821. PMID 12730666. S2CID 17619191.
  4. ^ Wang Y, Moorhead M, Karlin-Neumann G, Falkowski M, Chen C, Siddiqui F, Davis RW, Willis TD, Faham M (2007). "Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization". Nucleic Acids Res. 33 (21): e183. doi:10.1093/nar/gni177. PMC 1301601. PMID 16314297.
  5. ^ a b c d e f Akhras MS, Unemo M, Thiyagarajan S, Nyrén P, Davis RW, Fire AZ, Pourmand N (2007). Hall N (ed.). "Connector inversion probe technology: a powerful one-primer multiplex DNA amplification system for numerous scientific applications". PLOS ONE. 2 (9): e195. Bibcode:2007PLoSO...2..915A. doi:10.1371/journal.pone.0000915. PMC 1976392. PMID 17878950. open access
  6. ^ a b c d e f Hardenbol P, Yu F, Belmont J, Mackenzie J, Bruckner C, Brundage T, Boudreau A, Chow S, Eberle J, Erbilgin A, Falkowski M, Fitzgerald R, Ghose S, Iartchouk O, Jain M, Karlin-Neumann G, Lu X, Miao X, Moore B, Moorhead M, Namsaraev E, Pasternak S, Prakash E, Tran K, Wang Z, Jones HB, Davis RW, Willis TD, Gibbs RA (2005). "Highly multiplexed molecular inversion probe genotyping: over 10,000 targeted SNPs genotyped in a single tube assay". Genome Res. 15 (2): 269–275. doi:10.1101/gr.3185605. PMC 546528. PMID 15687290.
  7. ^ a b c d e Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary BP, Landegren U (1994). "Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection". Science. 265 (5181): 2085–2088. Bibcode:1994Sci...265.2085N. doi:10.1126/science.7522346. PMID 7522346.
  8. ^ J. D. Schiffman; Y. Wang; S. R. Vandenberg; P. G. Fisher; J. M. Ford; H. Ji; J. G. Hodgson (2008). "Molecular inversion probes (MIPs) identify novel copy number changes in pediatric gliomas". Journal of Clinical Oncology. 26 (15_suppl): 13006. doi:10.1200/jco.2008.26.15_suppl.13006.
  9. ^ Joshua D. Schiffman; Yuker Wang; Lisa A. McPherson; Katrina Welch; Nancy Zhang; Ronald Davis; Norman J. Lacayo; Gary V. Dahl; Malek Faham; James M. Ford & Hanlee P. Ji (2009). "Molecular inversion probes reveal patterns of 9p21 deletion and copy number aberrations in childhood leukemia". Cancer Genet Cytogenet. 193 (1): 9–18. doi:10.1016/j.cancergencyto.2009.03.005. PMC 2776674. PMID 19602459.
  10. ^ Xu HL, Xu WH, Cai Q, Feng M, Long J, Zheng W, Xiang YB, Shu XO (2009). "Polymorphisms and haplotypes in the caspase-3, caspase-7, and caspase-8 genes and risk for endometrial cancer: a population-based, case-control study in a Chinese population". Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18 (7): 2114–22. doi:10.1158/1055-9965.EPI-09-0152. PMC 2764360. PMID 19531679.
  11. ^ Wang Y, Carlton VE, Karlin-Neumann G, Sapolsky R, Zhang L, Moorhead M, Wang ZC, Richardson AL, Warren R, Walther A, Bondy M, Sahin A, Krahe R, Tuna M, Thompson PA, Spellman PT, Gray JW, Mills GB, Faham M (2009). "High quality copy number and genotype data from FFPE samples using Molecular Inversion Probe (MIP) microarrays". BMC Med. Genom. 2: 2–8. doi:10.1186/1755-8794-2-8. PMC 2649948. PMID 19228381. open access
  12. ^ Daly TM, Dumaual CM, Miao X, Farmen MW, Njau RK, Fu DJ, Bauer NL, Close S, Watanabe N, Bruckner C, Hardenbol P, Hockett RD (2007). "Multiplex assay for comprehensive genotyping of genes involved in drug metabolism, excretion, and transport". Clin Chem. 53 (7): 1222–30. doi:10.1373/clinchem.2007.086348. PMID 17510302.
  13. ^ a b Porreca GJ, Zhang K, Li JB, Xie B, Austin D, Vassallo SL, LeProust EM, Peck BJ, Emig CJ, Dahl F, Gao Y, Church GM, Shendure J (2007). "Multiplex amplification of large sets of human exons". Nat Methods. 4 (11): 931–936. doi:10.1038/nmeth1110. PMID 17934468. S2CID 7652504.
  14. ^ Meuzelaar LS, Lancaster O, Pasche JP, Kopal G, Brookes AJ (2007). "MegaPlex PCR: a strategy for multiplex amplification". Nat Methods. 4 (10): 835–837. doi:10.1038/nmeth1091. hdl:2381/3833. PMID 17873887. S2CID 21863017.
  15. ^ a b Fredriksson S, Baner J, Dahl F, Chu A, Ji H (2007). "Multiplex amplification of all coding sequences within 10 cancer genes by Gene-Collector". Nucleic Acids Res. 35 (7): e47. doi:10.1093/nar/gkm078. PMC 1874629. PMID 17317684.
  16. ^ a b Dahl F, Gullberg M, Stenberg J, Landegren U, Nilsson M (2005). "Multiplex amplification enabled by selective circularization of large sets of genomic DNA fragments". Nucleic Acids Res. 33 (8): e71. doi:10.1093/nar/gni070. PMC 1087789. PMID 15860768.
  17. ^ Bashiardes S, Veile R, Helms C, Mardis ER, Bowcock AM, Lovett M (2005). "Direct genomic selection". Nat Methods. 2 (1): 63–69. doi:10.1038/nmeth0105-63. PMID 16152676. S2CID 667227.
  18. ^ Albert TJ, Molla MN, Muzny DM, Nazareth L, Wheeler D, Song X, Richmond TA, Middle CM, Rodesch MJ, Packard CJ, Weinstock GM, Gibbs RA (2007). "Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization". Nat Methods. 4 (11): 903–905. doi:10.1038/nmeth1111. PMID 17934467. S2CID 3173711.
  19. ^ a b c Wang Y, Moorhead M, Karlin-Neumann G, Wang NJ, Ireland J, Lin S, Chen C, Heiser LM, Chin K, Esserman L, Gray JW, Spellman PT, Faham M (2007). "Analysis of molecular inversion probe performance for allele copy number determination". Genome Biol. 8 (11): R246. doi:10.1186/gb-2007-8-11-r246. PMC 2258201. PMID 18028543.
  20. ^ Krishnakumar S, Zheng J, Wilhelmy J, Faham M, Mindrinos M, Davis R (2008). "A comprehensive assay for targeted multiplex amplification of human DNA sequences". Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27): 9296–9301. Bibcode:2008PNAS..105.9296K. doi:10.1073/pnas.0803240105. PMC 2442818. PMID 18599465.

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