바이러스 정량화

Virus quantification

바이러스 정량화란 바이러스 농도를 파악하기 위해 샘플 내 바이러스 입자(바이러스)의 수를 세거나 계산하는 것입니다.다양한 단계의 바이러스 양이 모니터링되어야 하는 중요한 변수인 생산 상황뿐만 아니라 학술 및 상업 실험실의 연구 개발(R&D)에 모두 사용됩니다.예를 들어, 바이러스 기반 백신, 바이러스 벡터를 이용한 재조합 단백질 및 바이러스 항원의 생산은 제품 품질 및 생산 수율을 최적화하고 끊임없이 변화하는 요구 및 적용에 대응하기 위해 프로세스를 지속적으로 모니터링 및/또는 수정하기 위해 바이러스 정량화를 필요로 합니다.바이러스를 정량화할 필요가 있는 특정 사례의 다른 예로는 클론 스크리닝, MOI(Multiple of Infection) 최적화, 세포 배양에 대한 방법 적용 등이 있습니다.

바이러스 정량화 방법은 여러 가지로 분류할 수 있습니다.여기서 방법은 측정되는 것과 어떤 생물학적 맥락에 따라 분류됩니다.예를 들어, 세포 기반 검사는 일반적으로 감염 단위(활성 바이러스)를 측정합니다.다른 방법은 바이러스 단백질, DNA, RNA 또는 분자 입자의 농도를 측정할 수 있지만 반드시 감염성을 측정할 필요는 없습니다.각각의 방법에는 각각의 장점과 단점이 있으며, 이는 종종 어떤 [1]방법이 특정 응용 프로그램에 사용되는지를 결정합니다.

세포 기반 분석법

플라크 분석

헤르페스 심플렉스 바이러스의 바이러스 명판

플라그 기반 검사는 바이러스 농도를 감염량 측면에서 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다.플라크 분석은 바이러스 양을 측정하는 하나의 척도인 바이러스 샘플의 플라크 형성 단위(PFU) 수를 결정합니다.이 검사는 페트리 접시 또는 다중 우물 세포 배양 접시에서 수행되는 미생물학적 방법에 기초합니다.구체적으로, 숙주 세포의 합류 단층은 바이러스가 포함된 샘플을 다양한 희석으로 적용하여 감염된 후, 액체 배지에서 발생하는 것과 같이 바이러스 감염이 무분별하게 확산되는 것을 방지하기 위해 한천 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 반고체 배지로 덮습니다.바이러스 플라크는 바이러스가 고정된 세포 단층 [2]내의 세포를 감염시킨 후 형성됩니다.바이러스에 감염된 세포는 감염과 용해의 주기가 반복되는 인접한 세포로 감염을 묽게 만들고 확산시킬 것입니다.이것은 감염되지 않은 온전한 세포로 둘러싸인 감염되고 용해된 세포 (바이러스 플라크)의 영역을 만들 것입니다.플라그는 광학 현미경으로 볼 수 있거나 세포 염색 기술(예: 온전한 세포와 용해된 세포를 시각화하기 [3]위해 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색)을 사용하여 시각적으로 볼 수 있습니다.플라그 형성은 분석되는 바이러스에 따라 3-14일이 걸릴 수 있습니다.플라크는 일반적으로 수동으로 계산되며, 플라크 카운트는 감염 용액(세포에 처음 적용된 샘플)의 희석 인자와 함께 검체 단위 부피당 플라크 형성 단위 수(PFU/mL)를 계산하는 데 사용됩니다.PFU/mL 수치는 검체 내 감염성 바이러스 입자의 농도를 나타내며 형성된 각 플라크가 하나의 감염성 바이러스 [4][5]입자에 의한 초기 감염을 나타낸다는 가정에 근거합니다.

초점형성검사(FFA)

로타바이러스에 감염된 세포(위)와 감염되지 않은 세포(아래)

FFA(Focus Forming Assay)는 플라크 분석의 변형이지만, 플라크 형성을 검출하기 위해 세포 용해에 의존하는 대신, FFA는 실제 플라크가 형성되기 전에 감염된 숙주 세포와 감염 바이러스 입자를 검출하기 위해 바이러스 항원에 특이적인 형광 표지 항체를 사용하는 면역 염색 기술을 사용합니다.FFA는 세포막을 이용하지 않는 종류의 바이러스를 정량화하는 데 특히 유용합니다. 이 바이러스들은 플라크 분석에 적용될 수 없기 때문입니다.플라크 분석과 마찬가지로, 숙주 세포 단층은 바이러스 샘플의 다양한 희석물에 감염되고 감염 바이러스의 확산을 제한하는 반고체 오버레이 매체 아래에서 비교적 짧은 인큐베이션 기간(예: 24-72시간) 동안 배양되어 감염된 세포의 국소적인 클러스터(focci)를 생성합니다.플레이트는 이후 바이러스 항원에 대한 형광 표지 항체로 조사되고 형광 현미경 검사는 초점의 수를 세고 정량화하기 위해 사용됩니다.FFA 방법은 일반적으로 플라크 분석 또는 50% 조직 배양-감염-선량(TCID50) 분석보다 시간이 짧지만(아래 참조), 필요한 시약 및 장비 측면에서는 더 비쌀 수 있습니다.검사 완료 시간은 사용자가 세고 있는 영역의 크기에 따라서도 달라집니다.면적이 클수록 시간이 더 많이 소요되지만 샘플을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다.FFA의 결과는 밀리리터당 초점 형성 단위 또는 FFU/[6]mL로 표시됩니다.

TCID50 엔드포인트 희석 분석

TCID50(50% Tissue Culture Infectious Dose) 검사는 감염성 바이러스 역가를 측정하는 척도입니다.이 엔드포인트 희석 검사는 감염된 숙주의 50%를 죽이거나 접종된 조직 배양 세포의 50%에서 세포병리 효과를 생성하는 데 필요한 바이러스의 양을 정량화합니다.이 분석법은 바이러스의 치사량을 결정해야 하는 임상 연구 응용 프로그램이나 바이러스가 플라크를 [citation needed]형성하지 않는 경우에 더 일반적일 수 있습니다.조직 배양의 맥락에서 사용될 때, 숙주 세포는 도금되고 바이러스의 연쇄 희석이 추가됩니다.배양 후 각 바이러스 희석에 대해 세포 사망률(즉, 감염된 세포)을 수동으로 관찰하고 기록하며, 결과는 TCID50 [6][7]결과를 수학적으로 계산하는 데 사용됩니다.검사 방법과 원칙의 차이가 뚜렷하기 때문에 TCID와50 pfu/mL 또는 다른 감염성 검사 결과는 동등하지 않습니다.이 방법은 세포 감염 [8]시간 때문에 일주일까지 걸릴 수 있습니다.

TCID를 계산하는50 데 일반적으로 사용되는 두 가지 방법(EC50, IC50 및 LD50과 같은 다른 유형의 50% 엔드포인트를 계산하는 데 사용될 수도 있음)은 다음과 같습니다.

TCID와 PFU 간의 이론적 관계는 알려진 평균 비율(바이러스 역가)로 발생하는 임의의 이벤트(바이러스 입자)가 고정된 공간(우물 내 바이러스 매개체의 양)에서 발생할 가능성이 있는 확률 분포인 포아송 분포를 기준으로 약 0.69PFU = 1 TCID입니다.그러나 두 가지 검사 유형이 다르게 설정되어 있고 바이러스 감염성이 세포 나이, 오버레이 매체 등 다양한 요인에 매우 민감하기 때문에 실제로는 동일한 바이러스 + 세포 조합에도 이러한 관계가 유지되지 않을 수 있음을 강조해야 합니다.그러나 다음 참조는 관계를 다르게 정의합니다.

ATTC: "동일한 세포 시스템이 사용되고 바이러스가 해당 세포에 플라크를 형성하며 플라크 형성을 억제하는 절차가 추가되지 않는다고 가정하면 1mL의 바이러스 재고는 플라크 형성 단위(PFU)의 약 절반을50 TCID로 가질 것으로 예상됩니다.이는 추정치일 뿐이지만 도전 받은 세포층의 50%를 감염시키는 제한 희석은 초기에 감염되는 세포층에 하나의 플라크가 생성될 것으로 예상되는 경우가 많다는 이론적 근거에 근거합니다.어떤 경우에는 두 개 이상의 명판이 우연히 형성될 수 있으므로 실제 PFU의 수를 실험적으로 결정해야 합니다.

"TCID의50 네거티브 튜브는 플라크 형성 단위가 0이고 포지티브 튜브는 각각 하나 이상의 플라크 형성 단위를 나타내기 때문에 수학적으로 예상되는 PFU는 TCID의50 1/2보다 다소 클 것입니다.포아송 분포를 적용하면 더 정확한 추정치를 얻을 수 있습니다.서 P{\ P는 음의 튜브의 비율이고 m은 볼륨당 감염 단위의 평균 수(PFU/ml)이며 P = ⁡{\ P) =\입니다. TCID로 표현되는 임의의 역가에 대하여, = {\ P) = 입니다. exp⁡ (-m ) = {\(-m) = 이고 m = - ⁡ {\dispm-\ 0 즉 ~ 0.7입니다.

"따라서, 사람은 평균 PMU/ml 수를 예측하기 위해 TCID50 역가(ml당)에 0.7을 곱할 수 있습니다.이러한 계산을 실제로 적용할 때, 계산된 평균은 명판을 시각화하는 데 필요한 프로토콜의 변경이 TCID에50 사용되는 조건에서의 표현과 비교하여 감염성 바이러스의 표현을 변경시키지 않는 경우에만 유효하다는 것을 기억해야 합니다.

"따라서 작업 추정치로서 TCID가50 1 × 105 TCID50/mL인 재료는 0.7 × 105 PFU/mL가 생성된다고 가정할 수 있습니다."

단백질 및 항체 기반 분석

단백질 및 항체 기반 바이러스 정량 분석에는 여러 가지 변형이 있습니다.일반적으로, 이러한 방법들은 감염된 세포나 바이러스 입자의 수보다 모든 단백질의 양 또는 샘플 내의 특정 바이러스 단백질의 양을 정량화합니다.정량화는 일반적으로 비색 또는 형광 검출에 의존합니다.일부 분석 변형은 샘플에서 직접 단백질을 정량화하는 반면, 다른 변형은 정량화 전에 바이러스 성장을 허용하기 위해 숙주 세포 감염과 배양을 필요로 합니다.사용되는 변형은 주로 초기 샘플의 단백질 양(즉, 바이러스 단백질)과 검사 자체의 민감도에 따라 달라집니다.배양 및 바이러스 성장이 필요한 경우 분석 전에 세포 및/또는 바이러스 용해/소화를 수행하는 경우가 많습니다.대부분의 단백질 기반 방법은 비교적 빠르고[citation needed] 민감하지만 정확한 교정을 위해 품질 기준이 필요하며 실제 바이러스 입자 농도가 아닌 단백질을 정량화합니다.아래는 널리 사용되는 단백질 기반 분석의 구체적인 예들입니다.

혈액응고측정법

주요 기사:혈액응고측정법

HA(hemagglutination assay)는 인플루엔자에 특화된 일반적인 비형광 단백질 정량 검사입니다.그것은 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌이 적혈구를 응집시킨다는 사실에 의존합니다 (즉, 적혈구들이 뭉치게 합니다).이 분석에서는 인플루엔자 표본의 희석액을 1% 적혈구 용액과 1시간 동안 배양하고 응집이 처음 발생하는 바이러스 희석액을 육안으로 확인합니다.검사는 일반적인 PFU 대 HAU 비율이 106 [12][13][14]범위인 혈액응고 단위(HAU)의 결과를 생성합니다.이 검사는 완료하는 데 1~2시간이 소요됩니다.

혈구응집 억제 검사는 혈액 혈청의 독감 특이 항체 수준을 측정하는 데 사용되는 HA 검사의 일반적인 변형입니다.이 변화에서, 인플루엔자 바이러스에 대한 혈청 항체는 적혈구에 바이러스가 부착되는 것을 방해할 것입니다.따라서 항체가 충분한 [15]농도로 존재할 경우 혈구응집이 억제됩니다.

BCA(Bicinchoninic acid) 분석법

주요 기사:바이친코닌산 분석법

바이친코닌산 분석(BCA; a.k.a.Smith assay)는 단순한 비색 측정을 기반으로 하며 일반적으로 사용되는 단백질 정량 [16]분석입니다.BCA는 Lowry 또는 Bradford 단백질 분석과 유사합니다.BCA 분석 시약은 [17][18]2006년까지 특허를 보유했던 Pierce Chemical Company(현재 Thermo Fisher Scientific 소유)에 의해 처음 개발되고 상업적으로 만들어졌습니다.

BCA 분석에서 단백질의 펩타이드 결합은 Cu를 Cu로1+ 정량적으로 감소시켜2+ 옅은 파란색을 생성합니다.BCA는 Cu를 2:1 비율로 킬레이트하여1+ 562 nm에서 흡수하는 더욱 강렬한 색상의 종을 생성합니다.562 nm에서 시료의 흡광도는 시료 내의 벌크 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다.분광 광도계 또는 플레이트 [19]판독기로 분석한 후 검사 결과를 알려진 표준 곡선과 비교합니다.총 검사 시간은 30분에서 1시간입니다.이 분석법은 어디에나 있고 빠른 반면, 샘플의 모든 단백질을 세기 때문에 바이러스 단백질에 대한 특이성이 부족합니다.따라서 정량화될 바이러스 준비물은 매우 낮은 수준의 숙주 세포 단백질을 포함해야 합니다.

효소연계면역흡착제분석(ELISA)

주요 기사 : ELISA
ELISA 다이어그램

효소-결합 면역흡수제 검사(ELISA)는 샘플에서 알려지지 않은 양의 항원(예: 바이러스 단백질)의 존재를 검출하기 위해 효소(또는 효소와 연결된 두 번째 항체에 결합된)와 화학적으로 연결된 항원-특이적 항체를 사용하는 항체 기반 검사입니다.항체-항원 결합 이벤트는 기판 시약을 변환하는 효소의 능력을 통해 검출 및/또는 정량화되어 이후 시료 [20]내 표적 항원의 농도를 계산하는데 사용될 수 있는 검출 가능한 신호를 생성합니다.HRP(Horserradish peroxidase)는 신호를 증폭하고 분석 민감도를 증가시키는 능력 때문에 ELISA 체계에서 사용되는 일반적인 효소입니다.

ELISA 검사에는 여러 가지 변형 또는 유형이 있지만 일반적으로 간접, 경쟁, 샌드위치 또는 [21]역으로 분류할 수 있습니다.

단일 방사형 면역 확산(SRID) 검사

만치니 방법(Mancini method)으로도 알려진 단일 방사형 면역 확산 분석(SRID)은 반고체 배지(예: 한천)에서 면역 확산에 의해 특정 바이러스 항원의 양을 검출하는 단백질 분석법입니다.배지에는 관심 항원에 특이적인 항혈청이 들어 있고 항원은 디스크 중앙에 위치합니다.항원이 배지로 확산되면서 평형에 도달할 때까지 성장하는 침전 고리를 형성합니다.검사 시간은 항원과 항체의 등화 시간에 따라 10시간에서 며칠까지 가능합니다.링으로부터의 구역 직경은 단백질 농도 로그와 선형적으로 관련되어 있으며 [22]정량화를 위한 알려진 단백질 표준에 대한 구역 직경과 비교됩니다.

DNA와 RNA 분석

정량적 중합효소연쇄반응(qPCR)

주요 기사:정량 PCR 및 바이러스 부하

정량 PCR은 중합 효소 연쇄 반응 화학을 이용하여 바이러스 DNA 또는 RNA를 증폭하여 형광에 의한 검출 및 정량을 위해 충분한 농도를 생성합니다.일반적으로 qPCR에 의한 정량화는 교정 및 참조를 위해 알려지지 않은 샘플과 병렬로 분석되는 알려진 농도의 표준의 직렬 희석에 의존합니다.정량적 검출은 서열 특정 프로브 또는 SYBR [23]Green과 같은 비특이 형광 염료를 포함하는 다양한 형광 검출 전략을 사용하여 달성될 수 있습니다.TaqMan Molecular Beacons 또는 Scorpion과 같은 시퀀스별 프로브는 반응 중에 생성된 적절한 시퀀스의 DNA에만 결합합니다.SYBR 녹색 염료는 반응 중에 생성된 모든 이중 가닥[24] DNA에 결합합니다.

SYBR Green은 사용하기 쉽지만, 특이성이 부족하고 민감도가 낮아 대부분의 실험실에서 프로브 기반 qPCR 검출 [citation needed]방식을 사용하게 됩니다.qPCR에는 내부 표준이 [25]포함된 여러 샘플의 Ct 값(제품에서 통계적으로 유의한 증가를 보이는 PCR 사이클) 비교를 통해 상대적인 정량화를 허용하는 비교 임계값 방법을 포함한 많은 변형이 있습니다.

PCR은 용액 내의 유리 핵산뿐만 아니라 손상된 바이러스 입자로부터 온전한 감염 바이러스 입자로부터 기원한 것을 포함한 모든 표적 핵산을 증폭합니다.이 때문에 qPCR 결과(유전체 복사/mL로 표현)는 TEM 결과보다 양이 많을 가능성이 높습니다.바이러스 정량화의 경우, 전체 바이러스와 핵산의 복제물의 비율은 거의 1 대 1이 아닙니다.이것은 바이러스 복제 동안 핵산과 바이러스 단백질이 항상 1:1 비율로 생성되는 것은 아니며 바이러스 조립 과정에서 완전한 바이러스 이온과 빈 캡시드 및/또는 과잉 유리 바이러스 유전체가 생성되기 때문입니다.구제역 바이러스의 예에서 능동적으로 복제하는 숙주 세포 내에서 전체 바이러스 대 RNA 복제의 비율은 약 1:[26]1000입니다.qPCR에 의한 적정의 장점은 빠른 턴어라운드 시간(1~4시간)과 민감도(다른 방법보다 훨씬 낮은 바이러스 농도를 검출할 수 있음)를 포함합니다.

입자 분석법

가변 저항 펄스 감지(TRPS)

주요 기사:가변 저항 펄스 감지

가변 저항 펄스 감지(TRPS)는 크기 조절이 가능한 나노포어를 통해 [27]한 번에 하나씩 구동되는 개별 바이러스 입자의 고처리 단일 입자 측정을 허용하는 방법입니다.이 기술은 용액 내 바이러스 입자의 크기와 농도를 고해상도로 동시에 측정할 수 있는 장점이 있습니다.이는 총 바이러스 입자 농도(vp/mL)[28] 뿐만 아니라 시료 안정성과 응집체의 기여도를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

TRPS 기반 측정은 이온성 버퍼에서 발생하며, 분석 전에 시료의 사전 염색이 필요하지 않아 형광 염료로 사전 처리를 해야 하는 것보다 기술이 빠르며,[citation needed] 시료당 총 준비 및 측정 시간은 10분 이내입니다.TRPS 기반 바이러스 분석은 qViro-X 시스템을 통해 상업적으로 이용 가능하며, 이 시스템은 측정이 발생한 후 자동 파쇄에 의해 화학적으로 제염되는 기능을 가지고 있습니다.

단일 바이러스 유도 결합 플라스마 질량 분광법(SV ICP-MS)

이 기술은 Degueldre and Favarger(2003)[29]에 의해 발견된 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy, SP ICP-MS)과 유사하며 나중에 다른 나노 입자(예: 금 콜로이드, Degueldre et al(2006)[30] 참조)에 적용됩니다.SPICP-MS는 포괄적인 연구에서 단일 바이러스 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(SV ICPMS)의 분석을 위해 채택되었습니다.드겔드레 (2021).[31]본 연구에서는 단일 바이러스(SV) 식별 및 카운트를 위해 이 방법을 적용할 것을 제안합니다.SV 검출 모드에서 고해상도 다중 채널 섹터 필드(MCSF) ICP-MS 기록을 사용하면 마스터 및 키 이온의 카운트를 통해 단일 바이러스를 분석하고 식별할 수 있습니다.2-500 바이알 단위의 카운팅은 20초 안에 수행할 수 있습니다.마스터 이온(12C+, 13C+, 14N+, 15N+) 및 키 이온(31P+, 32S+, 33S+, 34S+)에 대한 Ar torch에서 분석을 수행할 것을 제안합니다.모든 간섭에 대해서 자세히 설명합니다.4중극 ICP-MS를 사용할 경우 분석을 업그레이드하기 위해 혐기성/호기성 대기가 있는 옵션을 탐색하는 동안 고해상도 MC ICP-MS를 사용하는 것이 좋습니다. 두 가지 바이러스 유형(SARS-COV2 및 박테리오파지 T5)에 대한 적용은 선별된 바이러스 이온에 대한 타임스캔 및 고정 질량 분석을 통해 조사되어 특성을 확인할 수 있습니다.N/C, P/C 및 S/C 몰비를 사용하고 수 농도를 정량화하는 e종.

기타논술

유세포분석법

주요 기사:유세포분석법

대부분의 유세포계는 [citation needed]민감도가 충분하지 않지만 바이러스 정량화를 위해 사용할 수 있는 몇 가지 상업적으로 사용 가능한 유세포계가 있습니다.바이러스 계수기는 형광을 이용하여 시료 내 온전한 바이러스 입자의 수를 정량화하여 공국화된 단백질과 핵산을 검출합니다.샘플은 단백질과 핵산에 특이적인 두 가지 염료로 염색되고, 레이저 빔을 통해 흐를 때 분석됩니다.바이러스 입자의 농도(vp/mL)[32]는 측정된 샘플 유량과 함께 두 개의 서로 다른 형광 채널 각각에 동시 이벤트를 발생시키는 입자의 양을 결정합니다.결과는 일반적으로 TEM 결과와 절대량이 유사합니다.검사의 선형 작업 범위는5 10–109 vp/mL이고 분석 시간은 ~10분이며 검체 준비 시간은 [citation needed]짧습니다.

투과전자현미경(TEM)

주요 기사:투과전자현미경
소아마비 바이러스의 음성 염색 TEM, Bar = 50 nm
신종 H1N1 바이러스의 조직 매립형 단면

TEM은 자기장으로 초점을 맞춘 전자빔을 이용하여 샘플을 이미지화하는 특수한 현미경 유형입니다.TEM은 광 현미경(0.2 [33]nm 이하의 해상도)보다 1000배 큰 공간 해상도의 이미징을 제공합니다.초박형의 음성 염색 시료가 필요합니다.샘플 준비는 코팅된 TEM 그리드에 샘플을 증착하고 전자 불투명 [34]액체로 음성 염색하는 것을 포함합니다.조직 내장 검체는 얇게 절편된 경우에도 검사할 수 있습니다.샘플 준비는 프로토콜과 사용자에 따라 다르지만 일반적으로 완료하는 데 몇 시간이 필요합니다.TEM 이미지는 개별 바이러스 입자를 보여줄 수 있으며 정량적 이미지 분석을 사용하여 바이러스 농도를 확인할 수 있습니다.이러한 고해상도 이미지는 대부분의 다른 방법으로는 불가능한 입자 형태 정보도 제공합니다.보고된 바이러스 유사 입자/mL(vlp/mL) 결과에서 감염성에 관계없이 모든 입자가 정량화되기 때문에 정량적 TEM 결과는 종종 다른 분석[citation needed] 결과보다 큽니다.정량적 TEM은 일반적으로 10 입자/mL6 이상의 바이러스 농도에서 잘 작동합니다.높은 기기 비용과 필요한 공간 및 지원 시설의 양 때문에 TEM 장비는 일부 실험실에서만 사용할 수 있습니다.

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