혈액응고 검사

Hemagglutination assay
왼쪽에서 오른쪽으로 희석된 여러 인플루엔자 검체의 혈당측정.
인간 진폐증에 대한 간접 혈당 측정법.왼쪽에서 오른쪽으로 희석된 다른 혈청 샘플.179번 샘플에서 Seropositivity가 의심되었다.

혈액검출검사 또는 혈액검출검사(HA)와 혈액검출억제검사(HI 또는 HAI)는 1941-42년 미국의 바이러스학자 조지 허스트가 바이러스, 박테리아 또는 항체의 상대농도를 정량화하는 방법으로 개발했다.[1]

HA와 HI는 적혈구(RBC) 표면의 시알산 수용체가 인플루엔자 바이러스(및 여러 가지 다른 바이러스) 표면에서 발견된 헤마글루틴 당단백질에 결합하여 상호 연결된 RBC와 바이러스 입자의 네트워크, 즉 격자 구조를 만드는 혈당화 과정을 적용한다.[2]응고된 격자는 RBC를 일반적으로 확산 불그스름한 용액으로 간주되는 부유된 분포로 유지한다.격자 형성은 바이러스와 RBC의 농도에 따라 달라지는데, 상대적 바이러스 농도가 너무 낮을 때는 격자에 의해 RBC가 제약을 받지 않고 우물 바닥에 정착한다.혈색소 침착은 포도상구균, 비브리오스, 그리고 다른 박테리아 종이 있는 곳에서 관찰되는데, 적혈구의 흡착을 유발하는 데 사용되는 메커니즘과 유사하다.[3][4]HA와 HI 검사에 사용되는 RBC는 일반적으로 RBC의 대상 바이러스 또는 박테리아와 관련 표면 수용체의 선택성에 따라 닭, 칠면조, 말, 기니피그 또는 인간에서 발생한다.

절차

HA에 대한 일반적인 절차는 다음과 같다. U 또는 V-bottom 형태의 96-well 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)에 있는 행 전체에 걸쳐 바이러스의 연쇄 희석이 준비된다.[5]첫 번째 우물에서 가장 농축된 표본은 흔히 재고량의 1/5로 희석되며, 후속 우물은 일반적으로 2배 희석(1/10, 1/20, 1/40 등)이다.최종 우물은 바이러스가 없는 음성 대조군의 역할을 한다.판의 각 행은 전형적으로 다른 바이러스를 가지고 있고 같은 형태의 희석 패턴을 가지고 있다.연속 희석 후에는 각 웰에 표준화된 RBC 농도를 더하고 부드럽게 혼합한다.판은 상온에서 30분간 배양한다.잠복기에 이어 분석 결과를 분석해 아글루트와 비아글루트 유정을 구분할 수 있다.한 줄로 늘어선 이미지는 일반적으로 바이러스 농도가 높고 적갈색 외관을 가진 응고된 우물에서 우물의 중앙에 짙은 붉은색 펠릿 또는 버튼을 포함하는 낮은 바이러스 농도의 일련의 우물로 진행된다.저농도 웰은 바이러스 백신 음성 대조군과 거의 동일하게 나타난다.버튼 모양은 RBC가 응고 격자 구조로 고정되지 않고 U 또는 V-bottom 우물 저점에 정착하기 때문에 발생한다.응고된 웰에서 비응고된 웰로의 전환은 1에서 2의 웰 안에서 뚜렷하게 일어난다.

바이러스 샘플의 상대 농도(titer)는 펠릿이 관찰되기 직전에 마지막 응고된 외관의 우물에 기초한다.[6]초기 바이러스 재고 농도와 비교하여, 이 우물에서의 바이러스 농도는 예를 들어 1/40배와 같은 재고 희석일 것이다.그 표본의 titer 값은 희석(즉, 40). 어떤 경우에는 초기에 바이러스가 너무 희석되어 응고된 우물이 전혀 관찰되지 않는 경우도 있다.이 경우, 이러한 표본의 titer는 일반적으로 가능한 가장 높은 농도를 나타내는 5로 할당되지만, 그 값의 정확도는 분명히 낮다.또는 바이러스의 상대 농도가 극도로 높고 우물이 단추 모양으로 절대 전환되지 않는 경우.그런 다음 일반적으로 titer 값은 5120과 같이 가장 높은 희석 값으로 할당된다.

HI는 HA 검사와 밀접하게 관련되어 있지만 바이러스-RBC 상호작용을 방해하기 위한 "억제제제"로서 항바이러스 항체를 포함한다.목표는 항체 또는 항체가 포함된 다른 검체의 항체 농도를 특성화하는 것이다.[7]HI 검사는 일반적으로 96웰 마이크로티터 판의 행에 걸쳐 항이소성 희석 시리즈를 생성하여 수행된다.각 행은 보통 다른 표본이 될 것이다.각 우물에는 표준화된 양의 바이러스나 박테리아가 첨가되며, 혼합물은 상온에서 30분간 배양할 수 있다.각 행의 마지막 우물은 바이러스가 첨가되지 않은 음성 대조군일 것이다.배양 중에는 항체가 바이러스 입자와 결합하며, 항체의 농도와 결합 친화력이 충분히 높으면 바이러스 입자가 효과적으로 혈액응고 작용을 일으키지 못하게 된다.[8]다음으로, 각 웰에 표준화된 양의 RBC가 추가되고 상온에서 30분 동안 배양될 수 있다.결과 HI 플레이트 영상은 항체 농도가 높은 비응고 '버튼' 웰에서 항체 농도가 낮은 응고 적색 확산 웰로 진행된다.HI titer 값은 혈청 분비를 완전히 억제한 혈청의 마지막 희석액과 역행하는 값이다.[9]

HA 및 HI 프로세스에 대한 앞의 설명은 일반화되어 있으며, 구체적인 세부사항은 운영자와 실험실에 따라 달라질 수 있다.예를 들어, 행에 걸친 연속적인 희석이 설명되지만, 일부 실험실은 대체 방향을 사용하고 대신 기둥 아래로 희석을 수행한다.마찬가지로 U 또는 V-bottom 플레이트의 시작 희석, 직렬 희석 계수, 배양 시간 및 선택은 특정 실험실에 따라 달라질 수 있다.

이점

HA와 HI는 검사가 간단하고, 비교적 저렴하고 사용 가능한 기기와 공급품을 사용하며, 몇 시간 내에 결과를 제공할 수 있다는 장점이 있다.이 분석은 또한 신뢰도, 비교, 표준화의 일부 측도를 허용하면서 전세계의 많은 실험실에서 잘 확립되어 있다.[10][11]

제한 사항

최적적이고 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 잠복시간, 적혈구 농도, 적혈구 유형 등 여러 변수를 제어해야 한다.[12]표본의 특정하지 않은 요인은 간섭과 잘못된 titer 값으로 이어질 수 있다.예를 들어 바이러스 특이 항체가 아닌 샘플의 분자는 바이러스와 RBC 사이의 응집력을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 항체가 바이러스에 결합하는 것을 잠재적으로 차단할 수 있다.수용체 파괴 효소(RDE)는 비특이적 억제를 방지하기 위해 분석 전에 시료를 처리하는 데 일반적으로 사용된다.[13]HA 또는 HI 결과의 분석은 플레이트를 읽고 티터 값을 결정하는 자격을 갖춘 개인에 의존한다.수동해석방식은 결과가 주관적일 수 있고 인간 독자 간의 합의가 일관되지 않기 때문에 분석에서 불일치할 수 있는 기회를 더 많이 도입한다.[14]또한 플레이트나 티터 결정에 대한 디지털 기록이 없으므로 초기 해석은 지루하고 반복실험으로 흔히 이루어진다.잠재적 변수의 범위와 전문가 독자들 간의 차이는 실험실 간 결과 비교를 어렵게 만들 수 있다.[15]

참고 항목

참조

  1. ^ Hirst, GK (1942). "The quantitative determination of Influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination". J Exp Med. 75 (1): 49–64. doi:10.1084/jem.75.1.49. PMC 2135212. PMID 19871167.
  2. ^ "Antigenic Characterization-Flu Activity & Surveillance- Seasonal Influenza (Flu)". CDC. 2019-10-15.
  3. ^ Neter, E; Gorzynski, EA; Zalewski, J; Rachman, R; Gino, RM (1954). "Studies on Bacterial Hemagglutination". American Journal of Public Health. 44 (1): 49–54. doi:10.2105/ajph.44.1.49. PMC 1620628. PMID 13114484.
  4. ^ Neter, E (1956). "Bacterial Hemagglutination and Hemolysis". Statler Research Laboratories and Department of Pediatrics, Children's Hospital, Laboratory of Bacteriology, Roswell Park Memorial Institute, and Departments of Pediatrics and Bacteriology, University of Buffalo, School of Medicine, Buffalo, New York. 20 (3): 166–182. PMC 180858. PMID 13363771.
  5. ^ WHO. "Serological detection of avian Influenza A (H7N9) virus infections by turkey haemagglutination-inhibition assay- Laboratory Procedures" (PDF). WHO.
  6. ^ WHO. "Serological detection of avian Influenza A (H7N9) virus infections by turkey haemagglutination-inhibition assay- Laboratory Procedures" (PDF). WHO.
  7. ^ Noah, DL; Hill, H; Hines, D; While, EL; Wolff, MC (2009). "Qualification of the Hemagglutination Inhibition Assay in Support of Pandemic Influenza Vaccine Licensure". Clin Vaccine Immunol. 16 (4): 558–566. doi:10.1128/cvi.00368-08. PMC 2668270. PMID 19225073.
  8. ^ Webster, R; Cox, N; Stohr, K (2002). WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance (PDF). WHO.
  9. ^ Virocyt. "An Overview of virus quantification techniques" (PDF). Virocyt. Archived from the original (PDF) on 2016-03-03. Retrieved 2015-06-08.
  10. ^ Virocyt. "An Overview of virus quantification techniques" (PDF). Virocyt. Archived from the original (PDF) on 2016-03-03. Retrieved 2015-06-08.
  11. ^ Noah, DL; Hill, H; Hines, D; While, EL; Wolff, MC (2009). "Qualification of the Hemagglutination Inhibition Assay in Support of Pandemic Influenza Vaccine Licensure". Clin Vaccine Immunol. 16 (4): 558–566. doi:10.1128/cvi.00368-08. PMC 2668270. PMID 19225073.
  12. ^ WHO. "Serological detection of avian Influenza A (H7N9) virus infections by turkey haemagglutination-inhibition assay- Laboratory Procedures" (PDF). WHO.
  13. ^ WHO. "Serological detection of avian Influenza A (H7N9) virus infections by turkey haemagglutination-inhibition assay- Laboratory Procedures" (PDF). WHO.
  14. ^ Wood, J; Laurie, K; Engelhardt, O (September 2013). "A Comparative Examination of Influenza Haemagglutination-Inhibition Assay Protocols – Development of a Consensus HI Protocol". No. 4th International Meeting. CONSISE.
  15. ^ Wood, JM; Major, D; Heath, A; Newman, RW; Hoschler, K; Stephenson, I; Clark, T; Katz, J; Zambon, MC (2012). "Reproducibility of serology assays for pandemic influenza H1N1: Collaborative study to evaluate a candidate WHO International Standard". Vaccine. 30 (2): 210–217. doi:10.1016/j.vaccine.2011.11.019. PMID 22100887.