This article has been published in the peer-reviewed journal PLOS Computational Biology (2013). Click to view the published version.

플로우 세포측정 생물정보학

Flow cytometry bioinformatics

플로우 세포측정 생물정보학은 플로우 세포측정 데이터에 생물정보학을 적용하는 것으로, 광범위한 계산 자원과 도구를 사용하여 플로우 세포측정 데이터를 저장, 검색, 구성 및 분석한다.흐름 세포측정 생물 정보학은 계산 통계와 기계 학습의 기술 개발에 광범위한 사용을 필요로 하며 이에 기여한다.플로우 세포측정법 및 관련 방법을 통해 다수의 단일 세포에서 여러 개의 독립된 바이오마커를 정량화할 수 있다.특히 2000년대에 플로우 세포측정 데이터의 다차원성과 처리량이 급격히 증가하면서 결과 공유를 위한 다양한 계산 분석 방법, 데이터 표준 및 공개 데이터베이스가 생성되었다.

계산 방법은 흐름 세포 측정 데이터의 전처리, 그 내 세포 집단의 식별, 샘플 간의 세포 집단의 일치, 그리고 이전 단계의 결과를 사용하여 진단과 발견을 수행하는 데 도움을 주기 위해 존재한다.전처리의 경우, 여기에는 스펙트럼 오버랩 보정, 시각화 및 분석에 도움이 되는 척도로 데이터 변환, 데이터 품질 평가, 샘플 및 실험에 걸친 데이터 정규화가 포함된다.모집단 식별을 위해 2차원 산란도(게이트)에서 모집단의 전통적인 수동 식별을 지원하고, 차원 축소를 사용하여 게이트를 지원하고, 다양한 방법으로 고차원 공간에서 모집단을 자동으로 찾을 수 있는 도구를 사용할 수 있다.또한 확률 비닝으로 알려진 밀도 유도 이진 공간 분할 기술 또는 조합 게이트와 같은 보다 포괄적인 방법으로 데이터를 특성화할 수도 있습니다.마지막으로, 플로우 세포측정 데이터를 이용한 진단은 상기 모든 방법을 포함하는 파이프라인의 일부로서 감독된 학습 기술 및 높은 스루풋 통계 방법에 의한 생물학적 중요성의 새로운 세포 유형의 발견에 의해 보조될 수 있다.

개방형 표준, 데이터 및 소프트웨어도 흐름 세포 측정 생물 정보학의 핵심 부분이다.데이터 표준에는 세포계의 데이터를 저장하는 방법을 정의하는 Flow Cytometry Standard(FCS; 플로우 사이토메트리 표준)와 실험 설계 및 분석 단계에 대한 보다 자세한 정보를 저장하기 위해 ISAC(International Associety for Advanced of Cytometry)가 개발 중인 몇 가지 새로운 표준이 포함됩니다.오픈 데이터는 2010년 CytoBank 데이터베이스와 2012년 FlowRepository의 개방으로 서서히 증가하고 있으며, 이 두 데이터베이스 모두 사용자가 자유롭게 데이터를 배포할 수 있으며, 후자는 ISAC에 의해 MIFlowCyt 호환 데이터의 우선 저장소로 권장되고 있습니다.오픈 소프트웨어는 바이오컨덕터 패키지 스위트 형태로 가장 널리 이용 가능하지만 GenePattern 플랫폼에서도 웹 실행이 가능합니다.

데이터 수집

주요 기사:플로우 세포 측정
유체 피복, 레이저, 광학(간단한 형태, 초점 생략), 광전자 증배관(PMT), 아날로그-디지털 변환기 및 분석 워크스테이션의 초점을 보여주는 흐름 세포계의 개략도

유동 세포계는 부유 세포가 유체 흐름 내에서 서로 분리되도록 유체 역학적으로 초점을 맞추어 작동한다.스트림을 하나 이상의 레이저로 조사하여 형광 및 산란된 빛을 광전자 증배기에 의해 검출한다.광필터를 사용함으로써 셀 위 또는 셀 내의 특정 형광구는 발광 스펙트럼의 피크에 의해 정량화할 수 있다.이들은 클로로필이나 트랜스제닉 그린 형광단백질 등의 내인성 형광체일 수도 있고 단백질 검출을 위한 항체 또는 DNA 또는 RNA 검출을 위한 교배 프로브와 같은 검출 분자에 공유 결합되어 있을 수도 있다.

이를 정량화할 수 있는 능력으로 인해 플로우 세포측정법이 다음을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용되고 있습니다.

2000년대 초반까지 플로우 세포측정법은 한 번에 몇 개의 형광 마커만 측정할 수 있었다.그러나 1990년대 후반부터 2000년대 중반까지 새로운 형광체의 급속한 개발로 인해 [7]세포당 최대 18개의 마커를 정량화할 수 있는 현대식 기기가 탄생했다.최근 들어서는 질량 세포 측정의 신기술이 형광체를 비행 질량 분석 시간에 의해 검출된 희토류 원소로 대체함으로써 34개 이상의 [8]표지자 발현을 측정할 수 있게 되었다.동시에 마이크로유체성 qPCR법은 [9]세포당 48개 이상의 RNA 분자를 정량화하는 플로우 세포측정법이다.흐름 세포 측정 데이터의 치수가 빠르게 증가하고 수백에서 수천 개의 샘플을 자동으로 분석할 수 있는 높은 처리량 로봇 플랫폼이 개발됨에 따라 개선된 계산 분석 [7]방법이 필요하게 되었습니다.

데이터.

3개의 산란 채널과 13개의 형광 채널이 있는 기기의 흐름 세포 측정 데이터를 나타냅니다.처음 30(수십만 개 중) 셀 값만 표시됩니다.

흐름 세포측정 데이터는 N개의 이벤트에 의해 M개의 파장에 걸쳐 강도의 큰 매트릭스 형태이다.대부분의 이벤트는 특정 셀이지만, 일부는 더블렛(레이저를 밀접하게 통과하는 셀의 쌍)일 수 있습니다.각 이벤트에 대해 특정 파장 범위에 걸쳐 측정된 형광 강도를 기록한다.

측정된 형광 강도는 세포 내 형광체의 양을 나타내며, 이는 항체와 같은 검출 분자에 결합되어 있는 양을 나타냅니다.따라서 형광 강도는 세포에 존재하는 검출기 분자의 양을 대신하는 것으로 간주할 수 있다.엄밀하게 정확하지는 않더라도 흐름 세포측정 데이터를 고려하는 간단한 방법은 각 원소가 분자의 양에 해당하는 M 측정치 x N 셀의 매트릭스입니다.

계산 흐름 세포 측정 데이터 분석 단계

FCM 데이터와 각 단계와 관련된 바이오컨덕터 패키지의 분석을 위한 파이프라인 예시.

1차 FCM 데이터에서 질병 진단 및 바이오마커 발견으로 이동하는 과정에는 네 가지 주요 단계가 포함된다.

  1. 데이터 전처리(보상, 변환, 정규화 포함)
  2. 세포집단 식별(일명 게이트)
  3. 교차 표본 비교를 위한 세포 모집단 일치
  4. 세포집단을 외부변수에 관련짓는다(진단 및 발견)

특정 흐름 세포 측정 워크플로우에서 수행된 단계를 저장하는 것은 일부 흐름 세포 측정 소프트웨어에서 지원하며 흐름 세포 측정 실험의 재현성에 중요합니다.그러나 저장된 워크스페이스 파일은 소프트웨어 [10]간에 교환할 수 있는 경우가 거의 없습니다.이 문제를 해결하기 위한 한 가지 시도는 Gating-ML XML 기반 데이터 표준(표준 섹션에서 더 자세히 설명)의 개발입니다. 이 표준은 상용 및 오픈 소스 흐름 세포 [11]측정 소프트웨어 모두에서 서서히 채택되고 있습니다.또한 CytoML R 패키지는 FlowJo, CytoBank 및 FACS Diva 소프트웨어와 호환되는 Gating-ML을 Import/export하여 공백을 메우고 있습니다.

data 전처리

분석에 앞서 흐름 세포측정 데이터는 일반적으로 전처리를 통해 아티팩트와 낮은 품질의 데이터를 제거하고 관심 세포군을 식별하기 위한 최적의 척도로 변환되어야 한다.다음은 일반적인 흐름 세포 측정 전처리 파이프라인의 다양한 단계입니다.

보상

같은 레이저에 여러 개의 형광색을 사용할 경우 방출 스펙트럼이 자주 겹칩니다.각 특정 형광 색소는 일반적으로 형광 색소의 발광 강도 피크 또는 그 근방에서 좁은 대역으로 설정된 밴드 패스 광학 필터를 사용하여 측정된다.그 결과 특정 형광색소의 판독치는 실제로 그 형광색소의 최대 방출 강도와 그 주파수 대역과 겹치는 다른 모든 형광색소의 스펙트럼 강도의 합이 됩니다.이 오버랩을 스필오버라고 하며, 플로우 세포 측정 데이터에서 스필오버를 제거하는 프로세스를 [12]보상이라고 합니다.

보상은 일반적으로 각 채널에 [12]대한 각 형광 색소의 기여도를 측정하기 위해 하나의 형광 색소에 대해 각각 착색된 일련의 대표 샘플을 실행함으로써 이루어집니다.각 채널에서 제거할 총 신호는 이 데이터를 기반으로 선형 방정식 시스템을 해결하여 스필오버 행렬을 생성함으로써 계산할 수 있습니다. 스필오버 행렬은 반전되어 셀로미터의 원시 데이터와 곱하면 보정된 [12][13]데이터가 생성됩니다.흐름 세포 측정 데이터를 보정하기 위해 미리 계산된 유출 매트릭스를 적용하거나 유출 매트릭스를 계산하는 프로세스는 흐름 세포 측정 소프트웨어의 [14]표준 기능입니다.

변혁

플로우 세포측정법에 의해 검출된 세포집단은 종종 거의 로그 정규발현을 [15]갖는 것으로 설명된다.따라서 전통적으로 로그 척도로 변환되어 왔습니다.초기 세포계에서는 로그 증폭기를 사용하여 데이터를 수집하기 전에도 종종 이 작업이 수행되었습니다.최신 계측기에서 데이터는 일반적으로 선형 형태로 저장되며 분석 전에 디지털로 변환됩니다.

그러나 보상된 흐름 세포측정 데이터는 보상으로 인한 음의 값을 포함하는 경우가 많고, 평균과 정규 분포를 [16]낮게 갖는 세포 집단이 발생한다.로그 변환에서는 음수 값을 제대로 처리할 수 없으며 정규 분포 셀 [16][17]유형이 제대로 표시되지 않습니다.이 문제를 해결하는 대체 변환으로는 로그 선형 하이브리드 변환[16][18] Logicle 및 Hyperlog,[19] 쌍곡선 아크사인 및 Box-Cox [20]등이 있습니다.

일반적으로 사용되는 변환을 비교한 결과, biexponential 변환과 Box-Cox 변환이 최적으로 매개 변수화되었을 때 [17]샘플 전체에서 세포 집단의 가장 명확한 시각화와 최소 분산을 제공한다는 결론을 내렸다.단, 이 비교에서 사용된 flowTrans 패키지의 나중에 비교한 결과 Logicle 변환은 다른 구현과 일관되게 파라미터화되지 않았음을 알 수 있으며 이러한 결과에 의문이 [21]제기될 수 있습니다.

품질 관리

특히 새로운 높은 처리량 실험에서는 개별 샘플의 기술적 오류를 검출하는 데 도움이 되는 시각화 방법이 필요합니다.한 가지 접근방식은 기술적 또는 생물학적 복제의 단일 차원에 대한 경험적 분포 함수와 같은 요약 통계를 시각화하는 [22]것이다.보다 엄밀하게 하기 위해 콜모고로프-스미르노프 검정을 사용하여 개별 표본이 표준에서 [22]벗어나는지를 판단할 수 있다.Grubbs의 특이치 검정을 사용하여 그룹에서 벗어난 표본을 탐지할 수 있습니다.

고차원 공간에서의 정도 관리 방법은 [23]풀링된 전체 데이터 집합에 적합한 빈을 사용하여 확률 비닝을 사용하는 것입니다.그러면 각 표본 내의 빈에 들어가는 셀 수의 표준 편차를 다차원 유사성의 척도로 간주할 수 있으며, 표준에 가까운 표본은 표준 [23]편차가 더 작습니다.이 방법을 사용하면 절대값이 빈의 수에 따라 부분적으로 달라지기 때문에 상대적인 측도이지만 표준 편차가 클수록 특이치를 나타낼 수 있습니다.

이러한 모든 방법을 사용하여 교차 표본 변동을 측정하고 있습니다.그러나 이는 계측기와 취급에 의해 도입된 기술적 차이와 측정을 원하는 실제 생물학적 정보의 조합이다.표본 간 변동에 대한 기술적 및 생물학적 기여도를 명확히 하는 것은 어렵거나 불가능한 [24]작업이 될 수 있다.

정규화

특히 다중심 연구에서 기술적 변화는 생물학적으로 동등한 세포 집단을 표본 간에 일치시키기 어렵게 할 수 있다.따라서 종종 영상 기록 기술에서 파생되는 기술적 차이를 제거하기 위한 정규화 방법은 많은 흐름 세포 분석에서 중요한 단계입니다.랜드마크 등록을 사용하여 싱글마커 정규화를 실행할 수 있습니다.이 경우 각 샘플의 커널 밀도 추정치 피크가 식별되어 [24]샘플 간에 정렬됩니다.

세포군 식별

선택한 3차원의 3가지 조합을 모두 포함하는 2차원 산란도.색상은 8개의 독립된 수동 게이트(폴리곤)와 자동 게이트(컬러 도트)의 컨센서스 비교를 나타냅니다.수동 게이트와 알고리즘의 합의는 CLUE 패키지를 사용하여 [25]생성되었다.에서 [26]재현된 그림입니다.

원시 흐름 세포 측정 데이터(수천에서 수백만 개의 세포에 대한 수십 개의 측정)의 복잡성으로 인해 통계 테스트 또는 감독 학습을 사용하여 질문에 직접 답하기 어렵다.따라서 흐름 세포측정 데이터 분석의 중요한 단계는 샘플 전체에서 공통 특징을 확립하면서 이 복잡성을 더 다루기 쉬운 것으로 줄이는 것이다.이것은 보통 기능적, 표현적으로 균질한 [27]세포군을 포함하는 다차원 영역을 식별하는 것을 포함한다.이것은 클러스터 분석의 한 형태입니다.이를 실현하는 방법은 다음과 같이 다양합니다.

게이트

흐름 세포계에 의해 생성된 데이터는 히스토그램 또는 산란도를 생성하기 위해 하나 또는 두 개의 차원으로 표시될 수 있습니다.이러한 플롯의 영역은 형광 강도에 따라 "게이트"라고 하는 일련의 부분 집합 추출을 만들어 순차적으로 분리할 수 있습니다.이러한 게이트는 예를 들어 소프트웨어를 사용하여 생성할 수 있습니다.Flowjo,[28] FCS Express,[29] WinMDI,[30] CytoPaint(일명 Paint-A-Gate),[31] VenturiOne, Cellcion, CellQuest Pro, Cytospec,[32] Kaluza.[33]또는 flowCore.

차원 수가 낮고 표본 간 기술 및 생물학적 가변성이 제한된 데이터 세트(예: 임상 실험실)에서 특정 세포 집단을 수동으로 분석하면 효과적이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있다.그러나 고차원 데이터 집합에서 많은 수의 세포 집단을 탐색적으로 분석하는 것은 [34]가능하지 않다.또한 덜 통제된 환경에서 수동 분석(예: 교차 실험실 연구)은 연구의 [35]전체 오류율을 증가시킬 수 있다.한 연구에서는 일부 변동이 있는 경우 수동 분석보다 [26]몇 가지 계산 게이트 알고리즘이 더 잘 수행되었다.그러나 계산 분석의 상당한 발전에도 불구하고 수동 게이트는 다른 세포 유형에서 잘 분리되지 않은 특정 희귀 세포 모집단의 식별을 위한 주요 해결책으로 남아 있다.

치수 축소에 의해 유도되는 게이트

조사해야 하는 산란도의 수는 측정된 마커 수의 제곱에 따라 증가한다(또는 [36]대부분의 마커에서 유사한 것으로 보이는 세포 유형 간의 고차원 차이를 해결하기 위해 각 세포 그룹에 대해 여러 번 조사해야 하므로 더 빠르다).이 문제를 해결하기 위해 주성분 분석을 사용하여 모든 [37]데이터 포인트의 분산을 최대화하는 마커 조합을 사용하여 고차원 데이터 세트를 요약했습니다.그러나 PCA는 선형 방식이기 때문에 복잡하고 비선형적인 관계를 유지할 수 없습니다.최근에는 수동 게이트 프로세스를 안내하기 위해 2차원 최소 스패닝 트리 레이아웃이 사용되었습니다.밀도 기반 다운샘플링 및 클러스터링을 사용하여 희귀 집단을 보다 잘 표현하고 최소한의 스패닝 트리 구축 [38]프로세스의 시간과 메모리 복잡성을 제어했습니다.보다 정교한 차원 축소 알고리즘은 아직 [39]조사되지 않았습니다.

최소 스패닝 트리에 대한 2D 레이아웃을 사용하여 치수 감소 후 수동으로 게이트된 고차원 질량 세포 측정 데이터 집합의 세포 집단.에 [40]기재된 데이터로부터 재현된 그림.

자동 게이트

세포군 식별을 위한 계산 도구 개발은 2008년 이후 활발하게 연구되고 있는 분야이다.모델 기반 알고리즘(예: flowCluster[41] 및[42] FLAME), 밀도 기반 알고리즘(예[43]: FLOCK 및 SWIFT), 그래프 기반 접근법(예: SamSPECRAL)[44] 및 가장 최근에는 여러 접근법(예[45]: FlowMeans 및 FlowPeaks[46])을 포함한 많은 개별 클러스터링 접근법이 최근에 개발되었습니다.이러한 알고리즘은 메모리와 시간의 복잡성, 소프트웨어 요건, 필요한 세포군의 수를 자동으로 결정하는 능력, 민감도와 특이성 측면에서 다릅니다.Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods(Flow Cytometry: 모집단 식별 방법의 비판적 평가) 프로젝트는 해당 분야의 연구 노력을 가진 대부분의 학회에서 적극적으로 참여함으로써 최첨단 자동 분석 [26]접근 방식을 객관적으로 교차 비교할 수 있는 방법을 제공하고 있습니다.다른 설문 조사에서도 [47][48][49][50]여러 데이터셋에서 자동화된 게이트 도구를 비교했습니다.

확률 비닝 방법

플로우를 사용하여 작성된 주파수 차분 게이트의 예FP 바이오컨덕터 패키지.점은 FCS 파일 내의 개별 이벤트를 나타냅니다.직사각형은 빈을 나타냅니다.

확률 비닝은 흐름 세포 측정 데이터를 일변량 기준으로 [51]분위수로 분할하는 비게이트 분석 방법입니다.그런 다음 카이 제곱 [51]검정을 사용하여 표본 간의 차이(분할되지 않는 변수)를 검정하는 데 분위수의 위치를 사용할 수 있습니다.

이것은 나중에 [52]중앙값을 따라 데이터가 반복적으로 분할되는 이진 공간 분할 기술인 주파수 차이 게이트의 형태로 다중 차원으로 확장되었습니다.이러한 파티션(또는 빈)은 관리 표본에 적합합니다.그런 다음 카이 제곱 검정을 통해 검사 표본에서 각 빈에 들어가는 셀의 비율을 대조군 표본과 비교할 수 있습니다.

마지막으로, 세포측정 핑거프린팅은 주파수 차이 게이트의 변형을 사용하여 빈을 설정하고 샘플의 [23]각 빈에 포함되는 셀 수를 측정합니다.이러한 빈은 게이트로 사용할 수 있으며 자동 게이트 방법과 유사하게 후속 분석에 사용할 수 있습니다.

조합 게이트

고차원 클러스터링 알고리즘은 종종 다른 주요 모집단과 잘 분리되지 않은 희귀 세포 유형을 식별할 수 없다.이러한 작은 세포 집단을 여러 표본에 걸쳐 일치시키는 것은 더욱 어렵다.수동 분석에서 사전 생물학적 지식(예: 생물학적 방제)은 이러한 모집단을 합리적으로 식별하기 위한 지침을 제공한다.그러나 이 정보를 탐색적 클러스터링 프로세스(예: 반감독 학습)에 통합하는 것은 성공하지 못했다.

고차원 클러스터링의 대안은 한 번에 하나의 마커를 사용하여 세포 집단을 식별한 다음 그것들을 결합하여 고차원 클러스터를 생성하는 것이다.이 기능은 FlowJo에서 [28]처음 구현되었습니다.flowType 알고리즘은 [53]마커를 제외할 수 있도록 함으로써 이 프레임워크를 기반으로 구축됩니다.이를 통해 각 마커의 중요성을 조사하고 고차원 [54]중복을 제외할 수 있는 통계 도구(예: RchyOptimyx)의 개발이 가능하다.

진단 및 검출

flowType/RchyOptimyx 파이프라인의 개요: 먼저 1차원 파티션(패널 1)을 조합하여 수만 개의 세포 집단을 식별합니다.그런 다음 생존 정보와 상관된 세포 집단을 식별하기 위해 통계 검정(및 다중 검사 보정을 위한 본페로니의 방법)을 사용하여 세포 집단을 분석합니다.세 번째 패널은 해당 셀 집단을 게이트화하는 모든 가능한 전략을 설명하는 완전한 게이트 계층을 보여줍니다.이 그래프는 "최상의" 게이트 전략(즉, 가장 중요한 마커가 이전에 나타나는 전략)을 식별하기 위해 채굴할 수 있습니다.선택한 모든 표현형에 대한 이러한 계층 구조는 패널 4에 나와 있습니다.패널 5에서 이러한 계층 구조는 전체 데이터 세트를 요약하고 각 표현형에 포함된 마커 수와 임상 결과와의 상관 관계 사이의 트레이드오프를 보여주는 단일 그래프로 병합된다(예: 패널 6의 카플란-마이어 추정기로 측정).그림 일부가[53] 와 [54]에서 재현되었습니다.

대상 세포군 식별 후 교차 샘플 분석을 수행하여 외부 변수(예를 들어 임상 결과)와 상관된 표현형 또는 기능적 변이를 식별할 수 있다.이러한 스터디는 두 개의 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다.

진단.

이러한 연구에서 목표는 보통 하나 이상의 세포 집단의 변화를 사용하여 질병(또는 질병의 하위 등급)을 진단하는 것입니다.예를 들어 다차원 클러스터링을 사용하여 클러스터 세트를 식별하고 모든 샘플에 걸쳐 일치시킨 다음 감독 학습을 사용하여 관심 클래스의 예측을 위한 분류기를 구성할 수 있다(예: 이 접근방식은 특정 림프종 하위 유형의 분류 정확도를[55] 개선하는 데 사용될 수 있다).또는 분류 [56]전 클러스터링을 위해 전체 코호트의 모든 세포를 단일 다차원 공간에 풀링할 수 있다.이 접근방식은 생물학적 변동(표본 간 매칭이 어려운)이 많은 데이터 세트에 특히 적합하지만 기술적 변동은 신중하게 [57]제어해야 한다.

검출

발견 설정에서 목표는 외부 변수와 상관된 세포 집단을 식별하고 설명하는 것이다(여러 세포 유형의 예측력을 결합하여 결과의 정확도를 최대화하는 것이 목표인 진단 설정과 반대).진단 사용 사례와 유사하게, 고차원 공간에서의 클러스터 매칭은 탐색적 분석에 사용될 수 있지만, 이 접근법의 기술력은 매우 제한적이다. 왜냐하면 먼저 차원성을 [56][58]감소시키지 않고는 고차원 공간에서의 세포 집단을 특성화하고 시각화하기가 어렵기 때문이다.마지막으로, 조합 탕구 접근법은 FCM 데이터의 탐색적 분석에 특히 성공했다.SPICE(Simplified Presentation of Understally Complex Evaluations)는 FlowJo의 게이트 기능을 사용하여 다양한 세포 집단을 통계적으로 평가하고 외부 결과와 관련된 결과를 시각화할 수 있는 소프트웨어 패키지입니다.flowType 및 RchyOptimyx(위에서 설명한 바와 같이)는 외부 결과와의 전체적인 상관관계에 대한 독립 마커의 영향을 탐색하는 기능을 추가하여 이 기술을 확장합니다.이를 통해 불필요한 마커를 제거할 수 있으며 식별된 모든 세포 유형을 단순하게 시각화할 수 있습니다.HIV+ 환자의 대규모(n=466) 코호트의 최근 분석에서, 이 파이프라인은 HIV에 대한 보호의 세 가지 상관관계를 확인했으며, 그 중 한 가지만 이전에 동일한 [53]데이터 세트의 광범위한 수동 분석을 통해 식별되었다.

데이터 포맷 및 교환

플로우 세포 측정 표준

주요 기사:플로우 세포 측정 표준

플로우 사이토메트리 표준(FCS)은 플로우 사이토메트리 [59]데이터의 기록과 공유를 가능하게 하기 위해 1984년에 개발되었습니다.그 이후 FCS는 모든 흐름 세포측정 소프트웨어 및 하드웨어 벤더에 의해 지원되는 표준 파일 형식이 되었습니다.FCS 규격은 전통적으로 국제 세포측정학회(ISAC)[60]에 의해 개발되고 유지되어 왔다.1990년에 [61]도입된 FCS 2.0, [62]1997년에 도입된 FCS 3.0, [63]2010년에 최신 사양인 FCS 3.1을 통해 플로우 세포 측정 및 컴퓨팅 기술의 기술적 진보에 적응하기 위해 수년간 업데이트가 통합되었습니다.FCS는 플로우 세포 측정에서 유일하게 널리 사용되는 파일 형식이었습니다.최근에는 ISAC에 의해 표준 파일 형식이 추가로 개발되고 있습니다.

넷 CDF

ISAC는 FCS를 흐름 세포 측정 고유의 Network Common Data Form(netCDF; 네트워크 공통 데이터 폼) 파일 [64]형식으로 대체하는 것을 검토하고 있습니다.netCDF는 어레이 지향 과학 데이터의 작성, 액세스 및 공유를 지원하는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 라이브러리와 머신에 의존하지 않는 데이터 형식 세트입니다.2008년 ISAC는 원시 흐름 세포측정 데이터를 [65]저장하기 위한 netCDF 규약의 첫 번째 버전을 작성했다.

아카이브 세포측정 표준(ACS)

ACS(Archival Cytometry Standard)는 세포측정 [66]실험을 설명하는 다른 구성 요소와 데이터를 묶기 위해 개발되고 있습니다.데이터, 메타데이터, 분석 파일 및 기타 컴포넌트 간의 관계를 캡처하고 감사 추적, 버전 관리 및 디지털 서명 지원을 포함합니다.ACS 컨테이너는 ZIP 파일 형식을 기반으로 하며 컨테이너 내의 파일 간의 관계를 지정하는 XML 기반의 목차입니다.XML 시그니처 W3C 권장사항은 ACS 컨테이너 내의 컴포넌트의 디지털 서명을 가능하게 하기 위해 채택되었습니다.ACS의 초안은 2007년에 설계되어 2010년에 완성되었습니다.이후 ACS 지원은 FlowJo 및 Cytobank 등의 여러 소프트웨어 툴에서 도입되었습니다.

게이트-ML

게이트 상호운용성의 결여는 전통적으로 흐름 세포측정 데이터 분석의 재현성과 여러 분석 도구의 사용을 방해하는 병목현상이었습니다.이 단점에 대처하기 위해 ISAC는 게이트 및 관련 데이터([10]스케일) 변환을 공식적으로 기술하는 XML 기반 메커니즘인 Gating-ML을 개발했습니다.Gating-ML의 초안 권장 버전은 2008년에 ISAC에 의해 승인되었으며 FlowJo, flowUtils, R/BioConductor의 CytoML 라이브러리, FlowRepository [66]등의 툴에 의해 부분적으로 지원됩니다.직사각형 게이트, 폴리곤 게이트, 볼록 폴리토프, 타원체, 의사결정 트리 및 다른 유형의 게이트의 부울 컬렉션을 지원합니다.또한 세포측정 데이터의 표시 또는 분석에 잠재적으로 유용한 것으로 나타난 수십 개의 공공 변환이 포함되어 있습니다.2013년, Gating-ML 버전 2.0은 ISAC의 Data Standards Task Force에 의해 권장사항으로 승인되었습니다.이 새로운 버전은 게이트 설명의 기능 측면에서 유연성이 약간 떨어집니다.단, 소프트웨어 [11]툴에서도 구현이 상당히 용이합니다.

분류 결과(CLR)

Classification Results(CLR) File[67] Format은 분류를 보고 및 처리할 수 있도록 수동 게이트 및 알고리즘 분류 접근법의 결과를 표준 방식으로 교환하기 위해 개발되었습니다.CLR은 일반적으로 지원되는 CSV 파일 형식을 기반으로 하며, 다양한 클래스에 대응하는 컬럼과 이벤트가 특정 클래스의 멤버가 될 가능성을 포함하는 셀 값을 포함합니다.이 값은 0 ~1 의 값으로 캡처됩니다.포맷의 단순성과 일반적인 스프레드시트 도구와의 호환성이 이 사양의 설계를 추진하는 주요 요건입니다.원래 흐름 세포측정학 분야를 위해 설계되었지만, 사실상 모든 종류의 물체의 애매하거나 모호하지 않은 분류를 포착해야 하는 모든 영역에 적용할 수 있다.

공개 데이터 및 소프트웨어

다른 생물 정보학 분야와 마찬가지로, 새로운 방법의 개발은 주로 무료 오픈 소스 소프트웨어의 형태를 취했으며, 오픈 데이터를 저장하기 위한 여러 데이터베이스가 만들어졌다.

오토게이트

AutoGate는[68] 보정, 게이트, 클러스터 미리보기, EPP(Expective Projection Pursit), 다차원 스케일링 및 페노그램 등을 수행하고 시각적 덴도그램을 생성하여 HiD 준비 상태를 표현합니다.학술기관, 정부기관 및 비영리기관의 연구자와 임상의는 무료입니다.

바이오컨덕터

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바이오컨덕터 프로젝트는 주로 R 프로그래밍 [69]언어로 작성된 무료 오픈 소스 소프트웨어의 저장소입니다.2013년 7월 현재 바이오컨덕터에는 플로우 세포측정 [70]데이터를 처리하기 위한 21개의 소프트웨어 패키지가 포함되어 있습니다.이러한 패키지는 이 문서의 앞부분에서 설명한 기능의 대부분을 커버하고 있습니다.

진패턴

주요 기사:진패턴

GenePattern은 유전자 발현, 프로테오믹스 및 기타 데이터를 분석하기 위한 200개 이상의 도구를 갖춘 게놈 분석 플랫폼입니다.웹 기반 인터페이스를 통해 이러한 도구에 쉽게 액세스할 수 있으며 재현 가능한 연구를 가능하게 하는 자동화된 분석 파이프라인을 생성할 수 있습니다.최근에는 프로그래밍 기술이 없는 실험자에게 고급 흐름 세포 측정 데이터 분석 도구를 제공하기 위해 GenePattern Flow Cytometry Suite가 개발되었습니다.플로우 세포 측정 표준(FCS) 파일의 기본 처리부터 세포군의 자동 식별, 정규화 및 품질 평가를 위한 고급 알고리즘에 이르기까지 약 40개의 오픈 소스 GenePattern 플로우 세포 측정 모듈을 포함합니다.내부적으로 이들 모듈의 대부분은 바이오컨덕터에서 개발된 기능을 활용합니다.

흐름 세포측정 분석을 위한 바이오컨덕터 패키지의 기능 대부분은 GenePattern[71] 워크플로우 시스템과 함께 사용하기 위해 GenePattern Flow Cytometry [72]Suite의 형태로 패키지화되었습니다.

FACSanadu

FACSanadu는[73] FCS 데이터의 시각화 및 분석을 위한 오픈 소스 휴대용 애플리케이션입니다.바이오컨덕터와 달리 비프로그래머를 대상으로 한 인터랙티브 프로그램이다.표준 FCS 파일 및 COPAS 프로파일데이터를 지원합니다.

hema.to

hema.to은 [74]림프종 의심환자의 플로우 세포측정 데이터 분류를 위한 웹 서비스입니다.도구 내의 인공지능은 심층 컨볼루션 뉴럴 네트워크를 사용하여 서로 다른 서브타입의 패턴을 인식합니다.모든 데이터와 코드가 열려 [75]있습니다.원시 데이터를 처리하므로 게이트가 불필요해집니다.새로운 데이터에 대해 최고의 성능을 발휘하려면 지식 전달에 의한 미세 조정이 필요합니다.[76]

공용 데이터베이스

MIFlowCyt(Minimum Information ab a Flow Cytometry Experiment, MIFlowCyt)는 간행물에 사용된 모든 흐름 세포 측정 데이터를 사용할 수 있어야 하지만,[77] 이는 공개 데이터베이스에 저장해야 하는 요건을 포함하지 않습니다.따라서 Nature Publishing Group의 모든 저널과 마찬가지로 Cytometry Part A와 B 저널은 MIFlowCyt 준수를 요구하지만, 아직 공개적으로 이용 가능한 흐름 세포측정 데이터는 거의 없다.그러나 공공 데이터베이스를 구축하기 위해 몇 가지 노력을 기울였다.

첫째, CytoBank는 완전한 웹 기반 흐름 세포 측정 데이터 저장 및 분석 플랫폼으로서 제한된 [78]형태로 일반에 공개되었습니다.CytoBank 코드 베이스를 사용하여 FlowRepository는 ISAC의 지원을 받아 2012년에 개발되었으며 흐름 세포 측정 [79]데이터의 공개 저장소가 되었다.FlowRepository는 MIFlowCyt 컴플라이언스를 [80]지원하며, 2013년 7월 현재 65개의 퍼블릭 데이터 [81]세트를 보유하고 있습니다.

데이터 세트

2012년 플로우 세포측정학 커뮤니티는 공개적으로 이용 가능한 데이터 세트를 출시하기 시작했다.기존 데이터 분석 과제를 나타내는 데이터셋의 서브셋은 다음과 같습니다.수동 게이트와 비교하기 위해 FlowCAP-I 프로젝트에서는 5개의 데이터셋을 공개했습니다.이 중 2개는 인간 분석가가 수동으로 게이트하고 2개는 8개의 독립 [26]분석가가 게이트했습니다.FlowCAP-II 프로젝트에는 바이너리 분류를 위한 3개의 데이터 세트가 포함되었으며, 이러한 샘플을 완벽하게 분류할 수 있는 몇 가지 알고리즘도 보고되었습니다.FlowCAP-III에는 수동 게이트와 비교할 수 있는 두 개의 대형 데이터셋과 까다로운 샘플 분류 데이터셋이 하나 더 포함되었습니다.2013년 3월 현재 FlowCAP-II의 공개는 아직 [82]진행 중입니다.FlowCAP-I, II 및 III에서 사용되는 데이터셋은 서브젝트 또는 파라미터 수가 적습니다.그러나 최근에는 HIV 감염 피험자 466명의 데이터 세트를 포함한 보다 복잡한 임상 데이터 세트가 출시되어 14개의 매개 변수 분석과 생존 [54][83][84][85]분석을 위한 충분한 임상 정보가 제공되고 있다.

데이터 세트의 또 다른 클래스는 고차원 질량 세포측정법이다.이러한 종류의 데이터셋은 광범위한 다른 [8]자극 하에서 30개 이상의 표면 또는 세포 내 마커를 사용하여 두 개의 골수 샘플을 분석하는 연구를 포함한다.이 데이터 세트의 원시 데이터는 원고에 설명된 대로 공개적으로 사용할 수 있으며, 표면 마커의 수동 분석은 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.

미해결 문제

흐름 세포측정 생물정보학 분야에서 급속한 발전에도 불구하고, 몇 가지 문제가 여전히 해결되어야 한다.

흐름 세포측정 실험 전체의 변동성은 샘플 간의 생물학적 변동, 사용된 기기 간의 기술적 차이 및 분석 방법에서 발생한다.2010년, 스탠포드 대학과 국립 보건원의 연구팀은 기술적 변화는 샘플 취급, 기기 설정 및 시약 선택을 표준화함으로써 개선될 수 있지만 분석 방법의 변화를 해결하려면 게이트의 유사한 표준화와 계산 자동화가 필요할 것이라고 지적했다.그들은 또한 데이터와 분석의 집중화가 실험 사이의 변동성을 [86]줄이고 결과를 비교하는 데 도움이 될 수 있다고 보았다.[86]

다른 그룹의 Pacific Biosciences 및 Stanford University 연구진은 클라우드 컴퓨팅을 통해 흐름 세포 측정 [87]실험을 중앙 집중식으로 표준화하고 높은 처리량을 분석할 수 있다고 제안했습니다.또한 표준 데이터 형식의 지속적인 개발과 채택이 [87]실험 전체의 변동성을 줄이는 데 계속 도움이 될 수 있다고 강조했다.그들은 또한 새로운 방법, 요약하는 biologists,[87]뿐만 아니라 유전자 발현과 같은 다른 실험 생물학적 정보를, 유전적 변형,metabolite 수준과 질병과 벌이는 대규모 유동 세포 분석 법. 데이터를 통합하는 방법에서 해석할 수 있는 방식으로 실험해 분석의 결과 모델에 필요할 것이다 s을 제안했다태팅을 하다es.[87]

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

이 문서는 CC BY 4.0 면허(2013)에 따라 다음 출처에서 수정되었다(검토자 보고서). Kieran O'Neill; Nima Aghaeepour; Josef Spidlen; Ryan Brinkman (5 December 2013). "Flow cytometry bioinformatics". PLOS Computational Biology. 9 (12): e1003365. doi:10.1371/JOURNAL.PCBI.1003365. ISSN 1553-734X. PMC 3867282. PMID 24363631. Wikidata Q21045422.

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