에피트랜시스토믹 시퀀싱

Epitranscriptomic sequencing

에피트랜시스토믹 시퀀싱에서 대부분의 방법은 (1) RNA 시퀀서 상에서 실행되기 전에 수정된 RNA 분자의 농축 및 정제 또는 (2) 수정 피크라고 부르도록 생체정보학 분석 파이프라인을 개선 또는 수정하는 데 초점을 맞춘다.tRNA 및 rRNA에 최적화된 5-메틸사이티딘 프로파일링을 위한 변형된 비황산염 염기서열처리를 제외하고 대부분의 방법이 mRNA 분자에 적합하고 최적화되었다.

에피트랜스코믹 시퀀싱 워크플로우 개요도

RNA 분자에는 N-메틸아데노신6, 2'-O-메틸화, N6,2'-O-디메틸라데노신, 5-메틸시티딘, 5-히드록실메틸시티딘, 이노신, 그리고 슈도우리딘의 [1][2]7가지 주요 화학 변형이 있습니다.각 수정 유형을 프로파일링하기 위해 다양한 시퀀스 방법이 개발되었습니다.각 방법과 사용되는 해당 생물정보학 도구와 관련된 척도, 분해능, 민감도 및 한계를 논의한다.

RNA 수정의 주요 클래스입니다.

N-메틸아데노신6 프로파일링 방법

아데노신의 메틸화는 티미딘 또는 우라실과 염기쌍을 이루는 능력에 영향을 미치지 않으므로 N-메틸아데노신6(mA6)은 표준 염기서열결정법 또는 [3]교배법으로는 검출될 수 없다.이러한 변형은 질소-6 위치에서 아데노신 염기의 메틸화에 의해 특징지어진다.폴리A+ mRNA에서 풍부하게 발견되며, tRNA, rRNA, snRNA 및 긴 ncRNA에서도 발견된다.

N-메틸아데노신을6 프로파일링하기 위해 개발된 방법.

m6A-seq 및 MeRIP-seq

2012년에 포유동물 [1]세포에서 m6A의 전사체 전체 프로파일을 가능하게 하는 m6A 염기서열 분석의 첫 번째 두 가지 방법이 나왔다.m6A-seq 및 MeRIP-seq(m6A 특이 메틸화 RNA 면역 침강)라고 불리는 이 두 가지 기술은 또한 모든 유형의 RNA 수정 시퀀싱을 허용하는 첫 번째 방법입니다.이 방법들은 포유동물 트랜스크립텀에서 10,000m6A 피크를 검출할 수 있었다. 피크는 3'에 농축된 것으로 밝혀졌다.UTR 영역, STOP 코돈 근처 및 긴 Exon [4][3]내.

두 가지 방법은 폴리(A)+ mRNA에서 메틸화 피크를 검출하기 위해 최적화되었지만 프로토콜은 모든 유형의 RNA를 프로파일링하도록 조정될 수 있었다. 수집된 RNA 샘플은 조각화 완충제를 사용하여 ~100-뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드로 단편화되며, 정제된 항체-태그 부착 RNA의 용출 및 포집MeRIP-Seq의 면역침강 절차는 m6A [3]배열을 130배 이상 농축할 수 있다.무작위 primed cDNA 라이브러리 생성에 이어 어댑터 결속 및 Illumina 시퀀싱이 수행되었습니다.RNA 가닥은 무작위로 잘리기 때문에 원칙적으로 m6A 부위는 시퀀스 판독이 정렬되는 영역의 중앙에 있어야 합니다.극단적으로 영역은 대략 200nt 폭(m6A [3]사이트의 업스트림 및 다운스트림 100nt)입니다.

전사체의 첫 번째 뉴클레오티드가 아데노신인 경우 리보오스 2'-O-메틸화 외에 이 염기는 N6 [1]위치에서 더욱 메틸화될 수 있으며 m6A-seq는 전사 시작 [5][4]부위에서 m6Am 피크를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.RNA 조각의 양단에서 어댑터 결찰은 전사체의 5' 말단에서 판독이 쌓이는 경향이 있습니다.Schwartz et al. (2015)는 입력 [4]샘플과 비교하여 IP 샘플의 파일업 크기 비율이 높은 사이트를 선택하여 mTSS 사이트를 검출하기 위해 이 지식을 활용했다.확인 결과, 고농축 파일업 부위의 80% 이상이 아데노신을 함유하고 있었다.

이러한 방식의 분해능은 100 ~200nt로 fragment사이즈 범위입니다이 두 가지 방법에는 여러 가지 단점이 있었다. (1) 상당한 입력 재료가 필요했고 (2) m6A 마크가 있는 실제 현장을 정확히 파악하기 어려웠으며 (3) 잘못된 양성을 [6]직접 평가할 수 없었다.

특히 MeRIP-Seq에서 현재 이용 가능한 생물정보학 도구는 약 100-200nt 폭 피크당 1개의 사이트만 호출할 수 있으므로 클러스터화된 m6A(클러스터 내의 각 개별 사이트 간 약 64nt)의 상당 부분이 [7][8]누락된다.각 클러스터는 최대 15m6A의 [7][8]잔류물을 포함할 수 있습니다.

2013년에는 m6A-seq와 MeRIP-seq의 분해능을 높이기 위한 이전 두 가지 방법에 기초한 m6A-seq의 변형 버전이 나와 효모 트랜스크립텀에서 이를 입증하였다.그들은 단편 크기를 줄이고 단편화된 RNA의 양끝을 캡처하는 결찰 기반 가닥 특이 라이브러리 준비 프로토콜을 사용하여 메틸화 위치가 배열된 [6]단편 내에 있음을 확인함으로써 이를 달성했다.m6A 컨센서스 모티브를 추가로 참조하고 음성 대조군 샘플을 사용하여 거짓 양성 m6A 피크를 제거함으로써 효모의 m6A 프로파일링을 단일 염기 분해능으로 수행할 수 있었다.

UV 기반의 방법

PA-m6A-seq

m6A-seq 위에 UV 유도 RNA-항체 가교작용을 첨가하여 분해능을 최대 23nt까지 높이는 PA-m6A-seq(광가교보조 m6A-seq)를 생성하였다.우선, 아마도 m6A 위치 부근에 있는 일부 혼입 부위인 배지에 4SU를 첨가함으로써 4-티오로딘(4SU)을 RNA에 혼입한다.그런 다음 m6A 특이 항체를 사용하여 전장 RNA에 대해 면역 침강을 수행한다[36].그런 다음 365nm의 자외선을 RNA에 비춰 4SU와의 항체에 대한 가교 작용을 활성화하였다. 가교 RNA는 경쟁 용출을 통해 분리되었고 약 25-30nt로 더욱 단편화되었다. 단백질분해효소 K는 가교 부위와 [6]항체 사이의 공유 결합을 분리하는 데 사용되었다.RNA에서 항체를 제거한 후 남아있는 펩타이드 조각은 역전사 시 염기가 T가 아닌 C로 읽혀져 4SU 가교 [6]부위에 점 돌연변이를 효과적으로 유도한다.짧은 조각은 라이브러리 구성 및 일루미나 시퀀싱을 거친 후 합의된 메틸화 시퀀스를 찾습니다.T to C 돌연변이의 존재는 메틸화 부위[1] 검출의 신호 대 잡음 비율을 증가시키고 메틸화 시퀀스에 더 높은 분해능을 제공한다.단점은 4SU를 탑재하지 않은 m6A 사이트는 검출할 수 없다는 점이다.또 다른 주의사항은 4SU 통합의 위치가 단일 m6A 잔기에 따라 달라질 수 있기 때문에 T-C 돌연변이를 사용하여 m6A 부위의 정확한 위치를 찾는 것은 여전히 어렵다는 것입니다.

m6A-CLIP 및 miCL아이피

m6A-CLIP(가교결합면역침강) 및 miCLIP(m6A 개인-뉴클레오티드 분해능가교결합 및 면역침강)는 UV 기반의 배열기술이다.이 두 가지 방법은 254 nm에서 가교(fragments RNA)를 활성화하고, 항체와 면역 침강 전에 RNA 분자를 fragment화하며, 광활성 리보뉴클레오시드의 결합에 의존하지 않는다. 즉, 항체는 m6A 부위에 염기 근접(매우 예측 가능한 위치)과 직접적으로 가교한다.이러한 UV 기반 전략은 m6A [7][8]부위의 보다 정확한 위치를 찾기 위해 활용될 수 있는 역전사 동안 cDNA 가닥에서 일관되고 예측 가능한 돌연변이 및 절단 패턴을 유도하는 항체를 사용한다.6A-CLIP 및 MLIP 및 M6A-CLIP 및 M6A-CLIP 응답)을 사용하여 단일 매핑할 수 있다.피우다ng.[7] 이와는 대조적으로 miCLIP에 의해 UV 매핑된 m6A 사이트는 전체 정밀 m6A 사이트의 작은 부분집합에 불과하다.m6A-CLIP에 의해 인간과 마우스 mRNA에서 수만 개의 m6A 부위의 정확한 위치는 m6A가 최종 엑손에서 농축되지만 [7]정지 코돈 주변에서는 농축되지 않음을 보여준다.

m6A-CLIP [8]및 miCLIP에서는 먼저 RNA를 ~20~80nt로 단편화한 후 m6A를 포함한 단편에서 254 nm UV 유도 공유가 RNA/m6A 항체 복합체를 형성하였다.항체는 역전사, 라이브러리 구축 및 염기서열결정 전에 단백질분해효소 K로 제거되었다.항체 제거 후 RNA의 가교 부위에 펩타이드 잔류물은 cDNA로 역전사하는 동안 삽입, 절단 및 C to T 돌연변이로 이어지며, 특히 시퀀스 [7][8]판독에서 m6A 부위로의 +1 위치(m6A 부위로의 5')에서 발생한다.m6A-CLIP 및 miCLIP를 사용하여 검출된 양성 사이트와 SCARLET을 사용하여 검출된 사이트의 일치율이 높았습니다(아래 참조). m6A-CLIP 및 miCLIP는 공간 분해능이 높고 잘못된 검출률이 [7][8]낮습니다.miCLIP는 크로스링크 인듀에서 m6am을 검출하는 데 사용되어 왔습니다.5' 지점에서의 절단 지점UTR.[8]

m6A 수정 상태를 정량화하는 방법

m6A 부위는 UV 기반 방법을 사용하여 고해상도로 프로파일링할 수 있지만, m6A 부위의 화학측정법(메틸화 상태 또는 RNA 유형 내 개별 부위별 m6A+ 대 m6A 비율)은 여전히 알려져 있지 않다.SCARLET(2013년)과 m6A-LAIC-seq(2016년)[1]는 각각 특정 궤적과 전사체 전체에 대한 화학량 측정을 가능하게 한다.

m6A 피크를 분석하는 데 사용되는 생물정보학 방법은 m6A 부위가 일반적으로 발견되는 배열 모티브에 대한 사전 가정을 하지 않으며 가능한 모든 모티브를 고려한다.따라서 사이트를 [8]놓칠 가능성이 낮아집니다.

주홍색

SCARLET(사이트 특이적 분할 및 방사성 라벨링에 이어 결찰 보조 추출 및 박층 크로마토그래피)은 특정 부위에서 메틸화 아데닌을 운반하는 샘플에서 RNA의 분율을 결정하는 데 사용된다.표적 RNA 분자를 위해 농축할 필요 없이 총 RNA로 시작할 수 있다.따라서 tRNA와 같은 저농도 RNA에서 메틸화 상태를 정량화하는 데 특히 적합한 방법이다.그러나 m6A 사이트의 [8][9]대규모 위치에는 적합하지 않거나 실용적이지 않습니다.

이 절차는 후보 수정 부위 주변의 표적 RNA에 대한 키메라 DNA 올리고뉴클레오티드 어닐링으로 시작한다.키메라 ssDNA는 2'OME/2'H 변형을 가지며 표적 서열을 보완한다.키메라 올리고뉴클레오티드는 RNase H가 후보 부위의 5' 말단에서 RNA 가닥을 정확하게 절단할 수 있도록 하는 가이드 역할을 한다.절단 부위는 인-32로 방사상 라벨링되고 DNA [10]연결효소를 사용하여 116nt ssDNA 올리고뉴클레오티드에 부목 결합된다.RNase T1/A는 116-mers DNA가 부착된 RNA 분자를 제외한 모든 RNA를 소화하기 위해 시료에 도입됩니다.이어서 이 방사성 라벨 생성물은 뉴클레아제에 의해 분리 및 소화되어 박층 크로마토그래피를 사용하여 분리된 수식 및 미수식 아데노신(5'P-m6A 및 5'-P-A)의 혼합물을 생성한다.두 그룹의 상대적 비율은 UV 흡수 [9]수준을 사용하여 확인할 수 있습니다.

m6A-LAIC-seq

m6A-LAIC-seq(m6A-level 및 isoform-characterization seqing)는 메틸화 상태를 전사체 규모로 정량화하는 높은 스루풋 접근법이다.이 방법에는 전체 길이 RNA 검체가 사용됩니다.RNA는 먼저 항m6A 항체로 면역 침강된다.m6A를 포함한 모든 RNA를 끌어내리기 위해 여분의 항체를 혼합물에 첨가한다.혼합물은 용출액(m6A+RNA)과 상등액(m6A-RNA) 풀로 분리된다.ERC(External RNA Controls Consortium) 스파이크 인스는 용출액 및 상등액에 추가되며 ERC 스파이크 인만으로 구성된 독립 제어 암도 추가됩니다.용출액 풀의 항체 절단 후, 3개의 혼합물은 각각 차세대 배열 플랫폼에서 배열된다.부위 또는 유전자당 m6A 수치는 다른 [1][11]풀의 ERCC 정규화 RNA 풍부성에 의해 정량화될 수 있다.전장 RNA가 사용되기 때문에 m6A+ 부분과 m6A- 부분 사이에 대체적으로 스플라이스된 아이소폼을 직접 비교하고 m6A+ 부분 내의 아이소폼 농도를 비교할 수 있다.

m6A 시퀀싱의 발전에도 불구하고, 몇 가지 과제는 여전히 남아 있다. (1) 동일한 전사물의 서로 다른 부위 사이의 화학 측정법을 특징짓는 방법은 아직 개발되지 않았다. (2) 분석 결과는 피크를 호출하는 데 사용되는 생물 정보학 알고리즘에 크게 의존한다. (3) 현재 방법은 모두 t에 대해 m6A 특이 항체를 사용한다.ag m6A 부위가 있지만, 항체는 RNA 배열에 대한 내재적 편향을 포함하고 있는 것으로 보고되었다.

2-O-메틸화 프로파일링 방법

리보스 부분의 2'-O-메틸화는 가장 일반적인 RNA 변형 중 하나이며 다양하고 매우 풍부한 비코드 RNA(ncRNA)와 mRNA의 [12]5' 캡에 존재한다.또한 많은 연구는 식물의 마이크로RNA(miRNA)와 동물의 PIWI-상호작용 RNA(piRNA)와 같은 일부 ncRNA에서 3' 말단 Nm이 나타난다는 것을 밝혀냈다.이러한 변형은 리보솜의 기능을 교란시키고 tRNA 디코딩을 방해할 수 있으며, 대체 스플라이싱 충실도를 조절하고, 3'-5' 핵분해로부터 ccRNA를 보호하며, 비자기 mRNA로부터의 자기 식별을 위한 분자적 신호를 제공할 수 있다.

Nm-REP-seq

새로운 방법인 Nm-REP-seq는 RNA 엑소리보핵산가수분해효소(Mycoplasma generalium RNase R, MgR) 및 주기산 산화반응성을 사용하여 2'-O-메틸화 [13]부위의 전사체 전체 식별을 위해 개발되었다.Nm-REP-seq는 Nm 함유 ncRNA의 새로운 등급으로 텔로머라아제 RNA 성분(TERC)과 scaRNA 및 snoRNA를 발견했으며 다양한 ncRNA 및 mRNA에서 많은 2-O-메틸화 부위를 확인했다.또한 Nm-REP-seq는 snoRNA, snRNA, tRNA 및 이들로부터 파생된 단편과 piRNA 및 miRNA의 3' 말단에 위치한 2'-O-메틸화를 밝혔다.

N6,2'-O-디메틸라데노신(m6Am) 프로파일링 방법

폴리A+mRNA에 풍부한 N6,2'-O-디메틸라데노신은 mRNA의 '[1]캡' 5' 말단에서 2'-O-메틸아데노신 잔기에 추가 메틸기가 첨가될 때 5' 캡 후 첫 번째 뉴클레오티드에서 발생한다.

m6Am은 전사 시작 부위에서 항m6A 항체에 의해 인식될 수 있으므로 m6A 프로파일링에 사용된 방법, 즉 m6A-seq 및 miCLIP에 적합할 수 있다(위의 m6A-seq 및 miCLIP 설명 참조).

5-메틸시티딘 프로파일링 방법

5-메틸시티딘 프로파일을 작성하기 위해 개발된 방법.

5-메틸사이티딘, m5C는 mRNA 및 ncRNA, 특히 tRNA 및 rRNA에서 풍부하게 발견된다.tRNA에서 이 수정은 2차 구조를 안정화시키고 안티코돈 스템 루프 [1]구조에 영향을 줍니다.rRNA에서는 m5C가 변환 충실도에 [1]영향을 줍니다.

m5C 시퀀싱 방법을 개발하기 위해 두 가지 원칙이 사용되었습니다.첫 번째 방법은 m6C 염기서열 분석과 유사한 항체 기반 접근법(비스업사이트 염기서열 분석 및 m5C-RIP)이다.두 번째는 효소를 표적에 공유 결합하고 표적 효소에 특정한 IP를 사용하여 표식을 포함하는 RNA 분자를 농축함으로써 m5C RNA 메틸전달효소의 표적을 검출하는 것이다(Aza-IP 및 miCLIP).


수정 아황산수소염 배열 분석

변형된 중황산염 배열은 Drosophila의 [14]rRNA, tRNA 및 miRNA 분자에 최적화되었다.중황산염 처리는 dm5C(DNA m5C) 검출에 가장 널리 사용되어 왔습니다.치료제는 기본적으로 시토신을 우리딘으로 전환하지만 메틸화 시토신은 치료법에 의해 변하지 않는다.아황산염 처리를 사용하여 m5C 염기서열처리 프로토콜을 개발하려는 이전의 시도는 분자의 현저한 저하를 야기하는 RNA의 가혹한 처리 문제를 효과적으로 해결할 수 없었다.특히 RNA의 아황산탈아미네이션 처리(높은 pH)는 포스포디에스터 결합의 안정성에 해롭다.그 결과 RNA 분자를 미리 풍부하게 하거나 딥 시퀀싱에 적합한 크기의 PCR 생성물을 충분히 얻기 어렵다.

이 아황산염 배열의 변형 버전은 Schaefer 등에 의해 개발되었습니다.(2009년)를 통해 중황산 RNA의 처리 온도를 95°C에서 60°[14]C로 낮췄다.수정의 근거는 RNA가 DNA와 달리 이중가닥이 아니라 단일가닥, 이중가닥줄기 구조 및 루프 영역으로 구성되기 때문에 훨씬 낮은 온도에서 RNA를 풀 수 있다는 것이었다.실제로 RNA는 예상 [14]크기의 PCR 앰피콘을 크게 손실하지 않고 60C에서 180분간 치료될 수 있다.탈아미노화율은 치료시 180min에서 99%로 결정되었다.

파편화된 RNA의 중황산 처리 후 역전사를 실시하고 이어서 cDNA 생성물의 PCR 증폭을 실시하여 마지막으로 Roche 454 [14]플랫폼을 사용하여 딥 시퀀싱을 실시하였다.

이 방법의 개발자는 Roche 플랫폼을 사용했기 때문에, 시퀀스 고유의 시토신 함량을 정량화하기 위해 심층 시퀀싱 데이터를 분석하기 위해 GS Amplicon Variant Analyzer(Roche)를 사용하기도 했습니다.그러나 최근 서류들은 여러 가지 결함이 있는 RNA(1)에 의한 2개)에 의한 비접촉을 포함시켰다.책임을 지다모든 메틸화 [1]부위를 올바르게 검출할 수 있을 만큼 시퀀싱 깊이가 높지 않습니다.

Aza-IP

Aza-IP 5-아자시티딘 매개 RNA 면역 침강은 m5C 마크를 형성하는 데 책임이 있는 두 가지 주요 효소인 NSUN2와 DNMT2의[18] 메틸 전달 효소의 표적 검출에 최적화되어 사용되었습니다.

우선 세포에 에피토프 태그 부착 m5C-RNA 메티전달효소 유도체를 과다 발현시켜 나중에 면역강화에 사용되는 항체가 해당 효소를 인식할 수 있도록 한다.둘째, 5-aza-C가 세포에 도입되어 시토신 대신 초기 RNA에 통합될 수 있다.일반적으로 메틸전달효소는 잔류물의 메틸화 후 방출된다(즉, 시토신과 메틸전달효소 사이의 공유결합이 파괴된다).5-aza-C의 경우, 시토신 C5 위치의 질소 치환에 의해 RNA 메티전달효소(Methytransferase)는 C6 [18]위치에서 표적 RNA 분자에 공유 결합되어 있다.

셋째, 세포를 용해하고 단백질과 공유결합하는 RNA 분자와 함께 관심 m5C-RNA 메틸전달효소를 면역촉진한다.IP 단계는 주로 tRNA인 RNA 표적의 200배 이상의 농도를 가능하게 했다.그 후 농축된 분자를 조각화 및 정제하고 cDNA 라이브러리를 구축하여 시퀀싱을 수행합니다.[18]

m-aza-C의 C5에 대한 RNA 메틸전달효소 공유결합이 재배열 및 고리개방을 유도하는 중요한 부가적 특징이다.이 링 개방은 시토신과 우선적으로 쌍을 이루므로 염기서열 분석 중에 구아노신(guanosine)으로 읽힌다.이 C-G 변환에서는 m5C 사이트의 [1]기본 해상도를 검출할 수 있습니다.한 가지 주의할 점은 5-아자사이토신으로 대체되지 않은 m5C 사이트가 손실된다는 것입니다.

miCLIP

miCLIP(메틸화 유도 가교 면역 침강)는 주로 tRNA와 같은 비부호화 RNA인 NSUN2 표적을 검출하기 위해 사용되었다.NSUN2의 C271A 유도변이는 RNA 타깃으로부터의 효소 방출을 억제한다.이 돌연변이는 관심 세포에서 과잉 발현되었고, 변이된 NSUN2에도 Myc 에피토프가 태그되었다.공유 결합 RNA-단백질 복합체는 Myc 특이 항체에 대한 면역 침강을 통해 분리된다.이러한 복합체는 인-32와 함께 방사선 라벨링을 통해 확인 및 검출된다.그런 다음 RNA는 복합체에서 추출되어 역전사되고, PCR로 증폭되며, 차세대 플랫폼을 사용하여 배열됩니다.

miCLIP와 Aza-IP는 모두 효소의 특정 타겟팅에 의해 제한되지만 깊은 [1]염기서열 분석 없이 저농축 메틸화 RNA를 검출할 수 있다.

이노신 프로파일링 방법

이노신은 아데노신 잔기가 변형될 때 효소적으로 생성된다.

이노신 식별 방법:이노신 염기쌍은 사이티딘과, 아데노신은 우라실과 쌍을 이룬다.

베이스 페어링 특성 분석

이노신의 화학적 구성은 탈아미네이트된 아데노신이기 때문에, 이것은 자본화될 수 있는 염기쌍의 변화를 수반하는 몇 안 되는 메틸화 변화 중 하나이다.따라서 rtPCR에 의해 얻어진 cDNA 배열은 해당 게놈 배열과 비교될 수 있으며, A 잔기가 반복적으로 G로 해석되는 부위에서 메틸화 현상을 가정할 수 있다.충분히 높은 정확도로 메틸화된 모집단의 mRNA 분자의 양을 백분율로 계산할 수 있다.이 방법은 잠재적으로 단일 뉴클레오티드 분해능을 가진다.실제로 현재 공개적으로 이용 가능한 풍부한 RNA-seq 데이터를 활용하여 G(cDNA) 대 A(게놈)를 조사할 수 있습니다.RNA 및 DNA 차이(RDD)라고 불리는 한 특정 파이프라인은 거짓 양성을 제외한다고 주장하지만, ICE-seq에[19] 의해 A-to-I 부위의 56.8%만이 유효한 것으로 밝혀졌다(아래 참조).

제한 사항

단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 체세포 돌연변이, 의사유전자 및 시퀀스 오류에 의해 발생하는 백그라운드 노이즈는 특히 단일 셀 [20]컨텍스트에서 신호의 신뢰성을 저하시킵니다.

화학적 방법

이노신특이분열

1997년에 개발된 A-to-I RNA 변형을 검출하는 첫 번째 방법은 이노신 특이적 분열이었다.RNA 시료는 글리옥살 및 붕산염으로 처리되어 모든 G 염기를 특이적으로 변형시킨 후, I 부위 후 분해되는 RNase T1에 의해 효소적으로 소화된다.이 단편들의 증폭은 분할 부위의 분석과 A-to-I 수정의 추론을 가능하게 한다.[21] 이것은 새로운 부위나 전사체 전체의 프로파일을 식별하기 보다는 특정 부위에서 이노신의 위치를 증명하기 위해 사용되었다.

제한 사항

Alu 요소에서 흔히 볼 수 있는 비교적 가까운 두 개의 A-to-I 수정이 존재한다는 것은 cDNA 합성이 이전 뉴클레오티드에서 잘리기 때문에 하류 수정이 검출될 가능성이 낮다는 것을 의미한다.throughput이 낮고 초기 방법에는 특정 primer가 필요합니다.프로토콜은 복잡하고 노동 집약적입니다.

ICE 및 ICE-seq

이노신 화학 소거(ICE)는 아크릴로니트릴과 이노신을 반응시켜 N1-시아노에틸리노신(ce1I)을 형성하는 공정을 말한다.이것은 역전사 효소를 멈추고 잘린 cDNA 분자를 유도하는 역할을 한다.이것은 ICE-seq라고 불리는 개발된 방법의 딥 시퀀싱과 결합되었다.데이터의 자동 분석을 위한 계산 방법을 사용할 수 있으며, 주요 전제는 잘린 트랜스크립트를 식별하기 위해 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플을 비교하여 판독 카운트에 의한 이노신 수정을 추론하는 것이며, 온라인 데이터베이스 [22]dbSNP와 비교하여 잘못된 긍정을 줄이는 단계이다.

제한 사항

원래 ICE 프로토콜은 RT-PCR 증폭 단계를 포함했으므로 최대 300–500bp의 cDNA 길이에 따라 프라이머와 위치 또는 영역에 대한 지식이 [23]조사되어야 했다.ICE-seq 방법은 노동, 시약 및 시간 집약적일 뿐만 아니라 복잡하다.2015년의 한 프로토콜은 22일이 [23][22][19]걸렸다.이것은 이노신 특이적 분할과 한계를 공유하는데, 상대적으로 가까운 곳에 두 개의 A-to-I 수정이 있을 경우, cDNA 합성이 이전 뉴클레오티드에서 [24]잘리기 때문에 하류 변형이 검출될 가능성이 적기 때문이다.ICE와 ICE-seq는 둘 다 자주 편집되지 않는 위치에 대한 민감도가 부족하여 어려움을 겪는다. 즉, 10% 미만의 빈도를 가진 수정과 거짓 양성을 구별하는 것이 어려워진다.판독 깊이와 품질이 증가하면 감도가 높아질 수 있지만 증폭 바이어스도 증가합니다.

생물학적 방법

ADAR의 녹다운

A에서 I로의 수정은 RNA(ADARs)에 작용하는 아데노신 탈아미나아제(adenosine demaminase)에 의해 영향을 받는데, 이 중 마우스에는 세 가지가 있다.따라서 세포에서 이러한 기능들의 녹다운과 이후 ADAR+ 및 ADAR-RNA 함량의 세포-세포 비교는 A-to-I 수정 프로파일링의 기초를 제공할 것으로 예상된다.그러나 세포 내에는 ADAR 효소의 추가적인 기능이 있다. 예를 들어, 그들은 RNA 처리와 miRNA 생물 형성에 있어 추가적인 역할을 한다. 이것은 세포 mRNA의 판도를 바꿀 가능성이 있다. 최근 쥐의 A-to-I 편집 맵은 편집 결핍된 ADAR1과 A-AR2를 더블 노크아웃 마우스로서 사용하여 생성되었다.제어.이것에 의해,[25] A-to-I 의 편집이 높은 신뢰도로 검출되었습니다.

의사우리딘메틸화프로파일링방법

ICE 기반 및 CMC 기반 이노신 및 의사우리딘 검출.두 경우 모두 잘린 cDNA 분자가 생성된다.

전반적으로 가장 풍부한 번역 후 RNA [26]변형인 의사우리딘(Pseudouridine)은 우리딘 염기가 이성화되었을 때 생성된다.진핵생물에서, 이것은 두 가지 다른 메커니즘 [27][28]중 하나에 의해 발생할 수 있다; 그것은 때때로 '제5의 RNA 뉴클레오티드'라고 불린다.그것은 [30][31]tRNA, rRNA 및 snRNA와 [29]같은 안정적인 비코드 RNA에 통합되며, tRNA에서 [32]리보솜 리간드 결합 및 번역 충실도, snRNA에서 분기 이벤트 및 스플라이싱 이벤트를 미세 조정하는 역할을 한다.C-글리코시드 결합이 상대물(정규 [33]우리딘)에서 발견되는 N-글리코시드 결합을 대체하였기 때문에 의사우리딘은 이미노 그룹의 수소 결합 공여체와 보다 안정적인 C-C 결합을 가지고 있다.이러한 변화는 염기쌍화 특성에 영향을 주지 않기 때문에 직접 염기서열을 지정했을 때 두 가지 모두 동일한 출력을 갖게 된다. 따라서 검출 방법은 사전 생화학적 수정을 [34]수반한다.

생화학적 방법

CMCT 방식

N-시클로헥실-N--b-(4-메틸모르폴리늄) 에틸카르보디이미드메토-p-톨루엔-술포네이트(CMCT, CMC라고도 함)의 첨가로 시작하는 여러 가지 의사우리딘 검출 방법이 있는데, 이는 의사우리딘과의 반응으로 인해 CMC-δC가 역전되기 때문이다.이 방법들은 단핵 분해능을 가지고 있다.최적화 단계에서, 아지도-CMC는 바이오티닐화를 추가할 수 있는 능력을 부여할 수 있다. 후속 비오틴 풀다운은 δ 함유 전사물을 풍부하게 하여 저농축 전사물을 식별할 수 있게 한다.

제한 사항

생화학적 변화 후에 시퀀싱이 선행되는 다른 절차와 마찬가지로, 높은 처리량 시퀀싱의 개발은 관심 부위와 프라이머 설계에 대한 사전 지식을 필요로 하는 한계를 제거했다.이 방법은 RNA 분해를 많이 일으키므로 많은 양의 샘플에서 시작하거나 증폭 편향을 설명하기 위해 효과적인 정규화 기법을 사용해야 합니다.마지막 한계는 Pseudouridine의 CMC 라벨 표시가 구체적이기 때문에 완전하지 않고 [36]정량적이지 않다는 것이다.특이성과 함께 높은 감도를 달성할 수 있는 새로운 반응물이 유익할 것입니다.

5-히드록실메틸시티딘 프로파일링 방법

위에서 논의한 시티딘 잔기는 5-히드록실메틸시티딘(hm5C)에 대해 한 번 산화되거나 5-포름시티딘(f5C)에 대해 두 번 산화되는 방식으로 추가로 수정될 수 있다.TET(ten-eleven translocation) 계열 효소에 의해 포유동물에서 m5C가 산화 처리됨으로써 발생하는 hm5C는 세 왕국 모두에서 발생하며 조절에 역할을 하는 것으로 알려져 있다.5-히드록시메틸시티딘(hm5dC)은 DNA에서 광범위하게 발견되는 것으로 알려져 있지만 hm5dC가 검출되지 않은 유기체에서도 발견되어 별도의 조절 규정을 가진 별도의 과정임을 알 수 있다.시토신 RNA 잔기에 대한 메틸기의 생체 내 첨가를 관찰하기 위해, 특정 동위원소를 포함하는 식단을 생쥐에게 먹일 수 있으며, LC-MS/MS 분석을 통해 이를 추적할 수 있다.핵융합에 대한 신진대사 경로의 대사 경로로 알려져 있기 때문에, NAM(SAM)과 SAM(SAM)에 첨가된 후, SAM)의 함량은 NAM(SAM)의 화학식[37]m5C와 대조적으로 코딩 [38]시퀀스 내에 대량의 hm5C 수정이 기록되었다.

hMeRIP-seq

hMeRIP-seq는 RNA-단백질 복합체가 안정성을 위해 가교되고 hm5C에 특이적인 항체가 첨가되는 면역침강법이다.이 방법을 사용하여, 3,000 hm5C 이상의 피크를 Drosophila melanogaster S2 세포에서 호출했습니다.

제한 사항

hm5dC에 대해 두 가지 고유한 기본 해상도 방법을 사용할 수 있지만 hm5C를 감지하는 기본 해상도 방법은 없습니다.

RNA 수식 생물물리학적 검증

질량 분석과 크로마토그래피 외에도 다른 두 가지 검증 기술이 개발되었습니다.

  1. 사전 및 사후 라벨링 기술:
  • 사전 라벨링 →에는 P가 포함된 배지에서 세포가 성장하므로 [α-P32]를 통합할 수 있습니다.T7 RNA 중합효소에 의한 전사 중의 NTP.그런 다음 수정된 RNA를 추출하고, 각 RNA 종은 분리되어 T2 RNase에 의해 후속적으로 소화된다.다음으로 RNA를 5' 뉴클레오시드 단인산염으로 가수분해하여 2D-TLC(2차원 박층 크로마토그래피) 분석한다.이 방법은 모든 수정을 검출하고 정량화할 수 있지만 시퀀스의 특성화에는 도움이 되지 않습니다.
  • 사후 라벨링 →은 시퀀스 내의 특정 위치에 대한 선택적 라벨링을 수반한다. 이러한 기법은 더 나은 검증 품질을 달성하기 위해 조정된 스탠리-바실렌코 접근 원리에 의존한다.우선 RNA는 배열특이적 가수분해에 의해 RNase H 또는 DNAzymes 중 하나에 의해 유리 5'-OH 단편으로 분할된다.그런 다음 폴리뉴클레오티드인산화효소(PKN)는 [γ-P32]를 사용하여 5' 방사성 라벨 부착 후 인산화를 수행한다.ATP. 이 시점에서 라벨에 표시된 조각은 크기 조각화 과정을 거치며, 뉴클레아제 P1에 의해 수행되거나 SCARLET 방법에 따라 수행될 수 있습니다.두 경우 모두 최종 생성물은 TLC에 의해 분석되는 5' 뉴클레오시드 단인산염(5' NMPs) 그룹이다.
    • SCARLET: 이 최근의 접근법은 한 단계뿐만 아니라 두 가지 배열 선택 단계를 이용하며, 마지막 단계는 긴 DNA 올리고뉴클레오티드와 함께 방사능 라벨이 부착된 조각의 부목 결찰 중에 얻어진다.분해 후 표지잔기를 결합 DNA 올리고뉴클레오티드와 함께 정제하여 최종적으로 가수분해하여 뉴클레아제 P1의 활성으로 방출한다.

이 방법은 m6A 및 δ와 같은 mRNA 및 lncRNA의 수정된 잔류물의 유효성 검사에 매우 유용한 것으로 입증되었다.

  1. 올리고뉴클레오티드 기반 기술: 이 방법은 여러 변종을 포함한다.
  • 3' 및 5' 뉴클레오티드에 대한 리가아제 감수성을 이용하는 특정 변형 DNA의 부목 결찰(지금까지 m6A, 2'-O-Me, δ에 사용)
  • 변형에 의한 기존 염기쌍의 장애(예: m1A, m1G, m22G)로 인해 cDNA 올리고뉴클레오티드의 이중안정성 저하를 이용하는 DNA칩을 통한 마이크로어레이 변형 식별
  • 낮은 dNTP 농도로 RT 프라이머 확장, RT 정지 [38]신호 매핑.

에피트랜스폼 시퀀싱을 위한 단일 분자 실시간 시퀀싱

단일분자실시간순서결정(SMRT)은 후생유전학 및 에피트랜스크립트롬 분야에서 사용된다.후생유전체학에서는 DNA 중합효소를 포착하기 위해 수천 개의 제로모드 도파관(ZMW)이 사용된다.변형 염기가 존재할 경우, 그 움직임의 생물물리학적 역학이 변화하여 염기 혼입 전, 도중 및 후에 독특한 운동학적 신호를 생성한다.SMRT 시퀀싱은 m6A 부위를 포함한 RNA의 변형된 염기를 검출하는 데 사용될 수 있습니다.이 경우 역전사효소를 ZMWs와 함께 효소로 사용하여 cDNA 합성을 실시간으로 관찰한다.합성 설계된 m6A 부위의 통합은 운동학적 신호를 남기며 인터펄스 지속시간(IPD)을 증가시킵니다.호모뉴클레오티드 스트레칭의 판독과 m6A의 염기 분해능에 관한 몇 가지 문제가 있는데, 이는 역전사효소의 말더듬으로 인한 것이다.둘째, 트랜스크립텀 전체의 접근법으로는 throughput이 너무 낮습니다.가장 일반적으로 사용되는 플랫폼 중 하나는 Pacific [39]Biosciences의 SMRT 시퀀스 처리 기술입니다.

에피트랜시스토믹스의 나노포어 배열 분석

SMRT 시퀀싱에 의한 에피트랜시스토믹 수정 검출의 가능한 대안은 나노포어 시퀀싱 기술을 이용한 직접 검출이다.이 기술은 막이나 고체 물질에 박혀 센서와 결합해 나노미터 크기의 단백질 채널을 이용해 모공을 통과하는 이온 전류의 진폭과 지속시간을 검출할 수 있다.RNA가 나노포어를 통과할 때 폐색은 전류 흐름의 중단을 초래하며, 이는 변형된 염기(변형 염기 포함)마다 다르므로 가능한 변형을 식별하는데 사용될 수 있다.단분자 판독을 생성함으로써 이전에 RNA 증폭 및 cDNA로 변환하지 않고 정량적 전사체 전체 [1]맵을 생성할 수 있습니다.특히 나노포어 기술은 RNA에 N-메틸아데노신6(m6A)과 5-메틸시토신(5-mC)이라는 두 개의 뉴클레오티드 유사체의 존재를 검출하는 데 효과적이었다.숨겨진 마르코프 모델(HMM) 또는 알려진 시퀀스로 훈련된 반복신경망(RNN)을 사용하여 수정된 뉴클레오티드가 모공을 통과할 때 이온 전류에 특징적인 교란을 발생시키고 이러한 데이터를 사용하여 뉴클레오티드를 [1][40]식별할 수 있음을 증명할 수 있었다.

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