아미노알 뉴클레오티드

Aminoallyl nucleotide
아미노릴우리딘(aa-UTP)

아미노알 뉴클레오티드(Aminoall nucleotide)는 알리아민(Alilamine)을 함유한 변형된 염기를 가진 뉴클레오그것들은 마이크로 배열에서 형광 검출에 의해 핵산의 사후 라벨링에 사용된다.그들은 형광 염료를 뉴클레오티드의 1차 아미노 그룹에 부착하는 것을 돕는 N-Hydroxysuccinimide 에스테르 그룹과 반응한다.이 뉴클레오티드는 보통 아미노알군이 우라실이나 시토신의 피리미딘 고리의 탄소 5에 부착되기 때문에 5-(3-아미노알)-뉴클레오티드로 알려져 있다.아미노산모이성의 1차 아민군은 알리파틱이며, 따라서 염기의 고리(자명)에 직접 부착되는 아민 그룹에 비해 반응성이 더 높다.아미노산 뉴클레오시드의 공통 명칭은 처음에는 아미노산을 나타내기 위해 aa- 또는 AA-로 약칭된다.5-탄소 설탕은 포함된 경우 데옥시리보스를 나타내는 소문자 "d"를 포함하거나 포함하지 않은 경우 리보스를 표시한다.마지막으로 질소 염기 및 인산염 개수가 표시된다(예: aa-UTP = 아미노릴 우리딘 3인산염).null

역사

aa-dUTP를[1] 사용하여 계층적으로 군집화된 열 지도

형광과 핵산을 결합하는 목적은 DNA나 RNA를 연구할 수 있는 비이소성 태그를 제공하는 것이었다.이런 종류의 표지는 과학자들이 다른 핵산과의 구조, 기능 또는 형성에 있는 DNA나 RNA를 연구할 수 있게 해준다.[2]형광 라벨의 첫 번째 베이스 수정은 1971년에 4-thiouridine과 4-thiouracil로 이루어졌다.[3]이 연구는 다른 연구들과 함께 아날로그, 효소를 통한 첨가 또는 다른 방법들을 통해 직접 및 비직접 라벨링의 다양한 유형을 포함시켰으며, 이를 통해 과학자들이 DNA를 연구하는데 뉴클레오티드의 라벨링을 훨씬 더 안전하게 만들었다.[2]

DNA 마이크로 어레이 분야에서 계측과 기술이 더욱 발전함에 따라, 더 많은 과학 연구를 위해 더 나은 시약과 기술이 필요할 것이다.Cy3를 사용한 형광 라벨링은 더 불충분하고 결과가 왜곡되는 것으로 나타났다; 대신 아미노알 뉴클레오티드 결합 방법을 선택했다.아미노알릴 뉴클레오티드를 간접 형광 라벨링으로 사용하는 것은 시안린 라벨링에서 보이는 민감성 문제를 무효로 하는 것처럼 보였다.[4]null

합성

아미노알 뉴클레오시드는 아래 그림과 같이 Heck coupling을 통해 합성할 수 있다.[5]null

Heck coupling aminoallyl nucleotide reaction

위의 이미지에서 왼쪽은 피리미딘 링의 다섯 번째 탄소에 요오드(요오드가 전기생성 할로겐화를 통해 첨가됨)를 가진 변형 뉴클레오사이드다.그것의 형성은 알리아민과의 반응과 연관될 수 있으며 헥 커플링을 통한 다양한 시약들은 염기에서 할로겐 그룹을 제거하고 알리아민을 첨가하여 오른쪽에 보이는 아미노릴 뉴클레오시드가 될 수 있다.[5]오른쪽의 생산물은 RNA 합성에서의 분자생물학에서 사용된다.[4][6][7]null

다른 반응으로는 다른 할로겐과의 단일 항아리 합성을 사용하는 것이 포함된다.[8]null

반응

아미노알릴 뉴클레오티드의 1차 아민은 시아닌과 특허 염료와 같은 아미노반응 염료와 반응하며, 이 염료에는[10][11] 숙시니미딜 에스테르(NHS)와 같은 반응성 이탈군이 포함되어 있다.기지 링에 직접 부착된 아민 그룹은 영향을 받지 않는다.이 뉴클레오티드는 DNA에 라벨을 붙이는 데 사용된다.[4][6][10][11][12]

Tagging modified uridine

사용하다

아미노알 NTP는 PCR, 닉 번역, 프라이머 확장 및 cDNA 합성에 간접 DNA 라벨링에 사용된다.[13]이러한 NTP라는 라벨이 붙어 있는 NTP는 방사능 물질을 처리할 능력이 없는 분자생물학 실험실에 적용되기 때문에 도움이 된다.예를 들어, 5-(3-Aminoallyl)-Uridine(AA-UTP)은 DNA의 사전 라벨링보다 DNA의 고밀도 라벨링에 더 효과적이다.NTP의 효소 첨가 후, 아민 반응제 형광 염료를 첨가하여 DNA 분자를 검출할 수 있다.[7]DNA/RNA 중합효소에 의해 DNA 또는 RNA 분자에 통합되었을 때, 5-(3-아미노랄)-UTP는 다른 화학 그룹의 추가를 위한 반응성 그룹을 제공한다.따라서 아미노 수정 DNA 또는 RNA는 아민-반응군이 있는 화합물로 라벨을 붙일 수 있다. 보조 염료 연결 시약과 함께 DNA/RNA에 통합된 AA-NTP는 배열 분석을 위해 탐색을 할 수 있다.[6]null

cDNA는 검출 목적으로 아미노산 라벨링에 의존한다.dNTP의 직접표시는 형광표시의 가장 빠르고 저렴한 방법이지만, 시퀀스로는 변형된 뉴클레오티드 하나만 사용할 수 있어 불리하다.직접 라벨링의 또 다른 단점은 부피가 큰 뉴클레오티드가 있지만, 이는 아미노릴 변형 뉴클레오티드를 사용한 간접 라벨링으로 극복할 수 있다.[14]라벨링 성공 여부를 쉽게 확인할 수 있는 방법은 색상이다.라벨을 잘 붙이면 최종 소재에 파란색(Cy5)이나 빨간색(Cy3) 색이 보인다.[15]null

cDNA 라벨 아미노알릴 준비 과정

아미노산 라벨링을 사용하는 또 다른 공정은 RNA를 증폭하는 매우 민감한 기술인 NASBA이다.이 특정한 경우, AAUTP 수정 RNA는 형광 시장 Cy3로 태그가 지정되었다.NASBA와 아미노알릴-UTP 라벨링이 결합되어 환경 모니터링, 생물학적 위협 탐지, 산업 프로세스 모니터링 및 임상 미생물학을 포함한 많은 미생물 진단 분야에 매우 유용하다.[16]DNA 마이크로어레이는 특히 AA-NTP의 DNA 마이크로어레이 검사를 더 빠르고 저렴하게 만드는 또 다른 방법이다.[12]null

합성 후 라벨링은 라벨링 효과가 동일한 프로브를 생성하여 Cy-labeled dNTPs의 효소 직접 결합에서 발견된 문제를 방지한다.간접 라벨링과 함께 아민 수정 NTP는 역전사, RNA 증폭 또는 PCR 중에 통합된다.아미노 동맹-NTP는 중합 시 수정되지 않은 NTP와 유사한 효율로 통합된다.[17][18]null

라벨링에 대한 우려 사항:아미노 수정 뉴클레오티드 아민 그룹은 시아닌 시리즈와 같은 염료 또는 기타 특허받은 염료와 반응한다.염료가 뉴클레오티드의 적절한 저장에 필요한 완충제와 반응할 때 문제가 발생한다.그러나 탄산염 완충제는 이 문제를 극복하는 데 사용될 수 있다.[19]null

참고 항목

참조

  1. ^ Hogan, Daniel J.; Riordan, Daniel P.; Gerber, André P.; Herschlag, Daniel; Brown, Patrick O. (2008). "Diverse RNA-Binding Proteins Interact with Functionally Related Sets of RNAs, Suggesting an Extensive Regulatory System". PLOS Biology. 6 (10): e255. doi:10.1371/journal.pbio.0060255. PMC 2573929. PMID 18959479.
  2. ^ a b Kricka, LJ; Fortina, P (Apr 2009). "Analytical ancestry: "firsts" in fluorescent labeling of nucleosides, nucleotides, and nucleic acids". Clinical Chemistry. 55 (4): 670–83. doi:10.1373/clinchem.2008.116152. PMID 19233914.
  3. ^ Secrist III, John A.; Jorge R. Barrio; Nelson J. Leonard (3 December 1971). "Attachment of a fluorescent label to 4-thiouracil and 4-thiouridine". Biochemical and Biophysical Research Communications. 45 (5): 1262–1270. doi:10.1016/0006-291x(71)90154-9. PMID 4332594.
  4. ^ a b c Farrell, Robert (2010-07-22). RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. p. 597. ISBN 9780080454764.
  5. ^ a b Reddington, Mark; Daniel Cunninghan-Bryant (12 January 2011). "Convenient synthesis of (E)-5-aminoallyl-2′-deoxycytidine and some related derivatives". Tetrahedron Letters. 52 (2): 181–183. doi:10.1016/j.tetlet.2010.10.137.
  6. ^ a b c Biosystems, Applied. "Modified Nucleotide 5-(3-aminoallyl)-UTP" (PDF).
  7. ^ a b Biotechnology, Trilink. "Modified Nucleotides" (PDF).
  8. ^ Kore, Anilkumar R.; Bo Yang; Balasubramanian Srinivasan (13 November 2013). "Fluorous-assisted synthesis of (E)-5-[3-Aminoallyl]-uridine-5′-triphosphate". Tetrahedron Letters. 54 (46): 6264–6266. doi:10.1016/j.tetlet.2013.09.026.
  9. ^ DeRisi, Joseph. "Amino-allyl Dye Coupling Protocol" (PDF). Retrieved 9 April 2014.
  10. ^ a b AnaSpec, Inc. "Hiyte Fluor Brochure" (PDF). Archived from the original (PDF) on 13 April 2014. Retrieved 9 April 2014.
  11. ^ a b life technologies. "Aminoallyl dUTP". Retrieved 24 March 2014.
  12. ^ a b Xiang, CC; Kozhich, OA; Chen, M; Inman, JM; Phan, QN; Chen, Y; Brownstein, MJ (Jul 2002). "Amine-modified random primers to label probes for DNA microarrays". Nature Biotechnology. 20 (7): 738–42. doi:10.1038/nb0702-738. PMID 12089562.
  13. ^ Gibriel, Abdullah (17 April 2012). "Options available for labeling nucleic acid samples in DNA micro-array-based detection methods". Briefings in Functional Genomics. II (4): 311–318. doi:10.1093/bfgp/els015. PMID 22510454.
  14. ^ Green, Michael. "Molecular Cloning-A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  15. ^ Ott, Scheler; Barry Glynn (2009). "Fluorescent labeling of NASBA amplified tmRNA molecules for microarray applications". BMC Biotechnology.
  16. ^ 't Hoen, PA; de Kort, F; van Ommen, GJ; den Dunnen, JT (Mar 1, 2003). "Fluorescent labelling of cRNA for microarray applications". Nucleic Acids Research. 31 (5): e20. doi:10.1093/nar/gng020. PMC 149842. PMID 12595569.
  17. ^ Kaposi-Novak, P; Lee, JS; Mikaelyan, A; Patel, V; Thorgeirsson, SS (Oct 2004). "Oligonucleotide microarray analysis of aminoallyl-labeled cDNA targets from linear RNA amplification". BioTechniques. 37 (4): 580, 582–6, 588. doi:10.2144/04374ST02. PMID 15517970.
  18. ^ Soundy, P; Wheeler, C.; Latham, H. (2001). "Preparing highly fluorescent, evenly labelled probes for microarray hybridization using the amino allyl method with CyScribe Post-Labelling Kit". Life Science News. 9: 17–19.

외부 링크

  • 홀리 베넷과 조 데리시에 의한 예시 프로토콜은 크리스 세이델이 수정한 로제타 정보학에서 비롯되었다.[1]
  1. ^ Seidel, Chris. "Fluorescent Probe Preparation". Retrieved 24 March 2014.