CUT&RUN 시퀀싱

CUT&RUN sequencing

표적 아래 갈라진 부분과 누클레이저를 이용한 방출이라고도 알려진 CUT&RUN 염기서열은 DNA와의 단백질 상호작용을 분석하기 위해 사용되는 방법이다. CUT&RUN 염기서열은 미세코크칼 누클리에 의한 항체 표적 통제 갈라진 부분과 대규모 병렬 DNA 염기서열을 결합하여 DNA 관련 단백질의 결합 부위를 식별한다.그것은 관심 있는 단백질의 전지구적 DNA 결합 사이트를 정밀하게 지도하는데 사용될 수 있다.현재, Chip-Seq는 단백질을 연구하기 위해 사용되는 가장 일반적인 기술이다.그러나 DNA관계는 CUT&RUN 시퀀싱이 하지 않는 여러 가지 실용적이고 경제적인 한계로 인해 어려움을 겪고 있다.null

사용하다

CUT&RUN 시퀀싱은 유전자 조절을 검사하거나 전사 인자 및 기타 염색질 관련 단백질 결합을 분석하는 데 사용할 수 있다.단백질-DNA 상호작용은 유전자 발현을 조절하며 많은 생물학적 과정과 질병 상태를 담당한다.이 후생유전적 정보는 유전자형과 표현 분석을 보완한다.CUT&RUN은 현재 Chip-seq의 표준에 대한 대안이다.Chip-Seq는 Chip-Seq 프로토콜의 교차 연결 단계로 인해 에피토프 마스킹을 촉진하고 거짓 양성 바인딩 사이트를 생성할 수 있어 한계를 겪고 있다.[1][2]또한 Chip-seq는 부최적 신호 대 잡음 비와 낮은 분해능으로 고생하고 있다.[3]CUT&RUN 시퀀싱은 신호 대 잡음 비율이 높아 더 간단한 기술로 시퀀싱 깊이가 덜 필요하다는 장점이 있다.[4]null

전사 인자와 같은 단백질과 직접 물리적 상호작용을 하는 특정 DNA 부위는 관심 단백질과 결합한 단백질-A(patient-A) 결합 마이크로코칼리 누클리스(MNase)에 의해 격리될 수 있다.MNase mediated cleavage는 관심 있는 단백질에 묶인 표적 DNA 부위의 라이브러리를 생성한다.준비된 DNA 라이브러리의 염기서열 분석과 전유전자 염기서열 데이터베이스와의 비교를 통해 연구자들은 후생유전 염색질 수정의 차이뿐만 아니라 대상 단백질과 DNA 사이의 상호작용을 분석할 수 있다.따라서 CUT&RUN 방법은 전사인자, 중합체, 구조 단백질, 단백질 변형, DNA변형을 포함한 단백질과 변형에 적용될 수 있다.null

워크플로우

CUT&RUN 시퀀싱 워크플로우의 시각적 표현

CUT&RUN은 마이크로코칼 누클리스(MNase)에 유전적으로 융합된 DNA 결합 단백질을 사용하는 크로마틴 내생성 분열(ChEC)에 대한 적응과 개선이다.이러한 전사 인자-MNase 융합 단백질은 관심 단백질의 DNA 결합 부위에서 DNA를 분해할 수 있다.[5]적응 과정에서 정제된 MNase는 단백질 A(pA)로 태그가 붙는데, 이는 세포에 첨가된 항체를 대상으로 하며 관심 있는 DNA 결합 단백질에 특유하다.CUT&RUN 과정에는 7가지 일반적인 단계가 있다.null

대상 아래 갈라진 틈새 및 누클레스트를 사용하여 해제

첫번째 단계는 핵들을 분리하기 위한 관심 세포들의 저선투석이다.그런 다음 핵은 원심분리되어 완충용액으로 세척되며, 강의식 코팅 자석 구슬로 복잡하게 된다.그리고 나서 렉틴-뉴클레아 콤플렉스는 관심 단백질을 대상으로 하는 항체로 다시 중단된다.그런 다음 항체와 핵은 핵이 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 버퍼에 세척되기 전에 약 2시간 동안 버퍼에 배양된다.다음으로, 핵은 단백질-A-MNase와 함께 완충기에 다시 매달려 1시간 동안 배양된다.그런 다음 핵은 다시 버퍼로 세척되어 결합되지 않은 단백질-A-MNase를 제거한다.다음으로, 관 속의 핵은 금속 블록에 위치하여 얼음물에 위치하며 CaCL을2 첨가하여 DNA를 DNA 결합 단백질 주위에 분할하기 위한 MNase의 칼슘 의존 누클레스 활성을 시작한다.단백질-A-MNase 반응은 킬레이트화제(EDTA, EGTA)를 첨가함으로써 진정된다.갈라진 DNA 파편들은 원심분리에 의해 핵이 펠로우로 배출되기 전에 1시간 동안 핵들을 배양함으로써 상등물로 방출된다.그런 다음 DNA 조각은 상등유에서 추출되어 염기서열 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있다.null

시퀀싱

Chip-Seq와 달리 시퀀싱 전에 크기를 선택할 필요가 없다.단일 시퀀싱 실행은 CUT&RUN 시퀀싱 방법론으로 현장에서 반응을 수행함으로써 달성되는 낮은 배경 때문에 고해상도 게놈 전체 연관성을 스캔할 수 있다.이와는 대조적으로 ChIP-Seq는 방법과 관련된 본질적으로 높은 배경 때문에 시퀀싱 깊이의 10배를 요구한다.[6]그런 다음 CUT&RUN DNA 파편을 식별하기 위해 샘플 시퀀스를 알려진 게놈 시퀀스에 정렬하는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 분석한다.[4]null

프로토콜

개방형 액세스 방법 저장소에서 사용할 수 있는 상세한 CUT&RUN 워크플로우가 있다.null

민감도

CUT&RUN 시퀀싱은 전사 인자-DNA 상호작용의 생체내 3D 확인을 유지하는 상황 프로파일링으로 인해 낮은 수준의 배경 신호를 제공하여 항체가 노출된 표면에만 접근할 수 있도록 한다.시퀀싱 민감도는 시퀀싱 실행의 깊이(즉, 매핑된 시퀀스 태그의 수), 게놈의 크기 및 목표 인자의 분포에 따라 달라진다.시퀀싱 깊이는 비용과 직접 상관되며 배경과 부정적으로 상관된다.따라서 저백그라운드 CUT&RUN 시퀀싱은 기본적으로 하이백그라운드 Chip-Sequencing보다 비용 효율적이다.null

CUT&RUN을 기존 Chip과 비교한 H3K27me3 표적 시퀀싱 결과에 대한 피크 호출 표현.여기서 CUT&RUN은 기존 Chip보다 향상된 신호 대 잡음 비를 제공하는 것으로 보인다.이러한 이점은 시퀀싱 비용을 낮춘다는 것을 의미한다.

현재 연구

새로운 CUT&RUN 기술을 활용한 연구 프로젝트가 이미 다수 있었다.null

인간의 경우 태아 글로빈 유전자 촉진제를 살펴보는 연구자들은 CUT&RUN을 사용하여 HBBP1 유전자 영역의 기능을 매개하는 데 있어 단백질 BCL11A의 관여를 조사함으로써 헤모글로비노패스 치료용 게놈 편집의 잠재적 대상을 부각시켰다.[11][12]null

한 연구단체가 CUT&RUN을 이용해 DNA 전사 중 핵분열과 관련된 중간자를 식별해 구조 후생유전체학의 일반적인 전략을 검증했다.[13]null

인간과 아프리카 녹색원숭이에서 CHET&RUN을 사용하는 연구자들은 CENP-B 단백질(센트로메르 형성의 중요한 단백질)과 결합 부위가 큰 유인원에 특유하다고 판단,[14] 인공 센트로메르 기능에 필요한 CENP-B가 비필수적이라는 역설을 해결했다.null

계산분석

많은 고투과 시퀀싱 접근방식과 마찬가지로, CUT&RUN-seq는 매우 큰 데이터 세트를 생성하며, 여기에는 적절한 계산 분석 방법이 필요하다.CUT&RUN-seq 읽기 카운트 데이터에서 DNA 결합 사이트를 예측하기 위해 피크 호출 방법이 개발되었다.null

피크콜링은 Chip-seq 또는 CUT&RUN-seq 실험에서 매핑된 판독값이 많은 게놈의 영역을 찾아내어 전사인자가 결합되는 게놈의 영역을 예측하는 알고리즘을 사용하는 과정이다.MACS는 Chip-seq 데이터에 대해 특히 인기 있는 피크 호출 알고리즘이다.[15]SEACR은 진부한 음성이 알려진 데이터 세트에 대해 CUT&RUN의 정확성을 확실하게 검증하는 고선택적 피크 호출자 입니다.[16]null

CUT&RUN-seq 피크 호출에 대한 인과적 DNA 결합 모티브를 식별하려면 MEME 모티브 찾기 프로그램을 CUT&RUN 시퀀스에 적용하면 된다.여기에는 모티브 정렬 및 검색 도구(MAST)와 함께 위치별 채점 매트릭스(PSSM)를 사용하여 획득한 시퀀스 읽기와 일치하는 참조 게놈에서 모티브를 식별하는 작업이 포함된다.[4]이 과정을 통해 전사-인자 결합 모티브의 식별이 가능하거나, 결합 모티브가 이전에 알려진 경우 이 과정을 통해 실험의[17] 성공 여부를 확인할 수 있다.

제한 사항

CUT&RUN-seq의 주요 제한사항은 칼슘 의존성 MNase 반응의 부적절한 타이밍으로 인한 DNA 과소화 가능성이다.효소성 또는 소닉화 DNA 절삭을 최적화해야 하는 현대의 ChIP-Seq 프로토콜에도 유사한 제한이 존재한다.Chip-Seq와 마찬가지로 관심 단백질을 대상으로 한 양질의 항체가 필요하다.null

유사한 방법

  • Sono-Seq: Chip-Seq와 동일하지만 면역억제 단계가 없다.
  • HITS-CLIP: DNA가 아닌 RNA와의 상호작용을 검출하기 위해 CLIP-Seq라고도 한다.
  • PAR-CLIP: 세포 RNA 결합 단백질의 결합 부위를 식별하는 방법.
  • RIP-칩: Chip-Seq와 유사하지만 교차 연결 방법을 채택하지 않고 시퀀싱 대신 마이크로 어레이 분석을 활용한다.
  • SELEX: 컨센서스 바인딩 시퀀스를 결정하기 위해 사용됨.
  • 경쟁-치IP: DNA에 대한 상대적 대체 역학 측정.
  • ChiRP-Seq: RNA 결합 DNA와 단백질을 측정한다.
  • Chip-exo: exonuclease 치료법을 사용하여 최대 단일 base-pair 해상도 달성
  • Chip-nexus:최대 단일 base-pair 해상도를 달성할 수 있는 Chip-exo의 잠재적 개선.
  • DRIP-seq: S9.6 항체를 사용하여 세 가닥 DND 침전:RNA 하이브리드는 R-루프라고 불린다.
  • TCP-seq: 주로 mRNA 번역 역학을 측정하는 유사한 방법.
  • DamID: 항체가 없는 단백질-DNA 상호작용을 검출하기 위해 메틸화 DNA 서열의 농축을 이용한다.

참고 항목

참조

  1. ^ Meyer CA, Liu XS (November 2014). "Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology". Nature Reviews. Genetics. 15 (11): 709–21. doi:10.1038/nrg3788. PMC 4473780. PMID 25223782.
  2. ^ Baranello L, Kouzine F, Sanford S, Levens D (May 2016). "ChIP bias as a function of cross-linking time". Chromosome Research. 24 (2): 175–81. doi:10.1007/s10577-015-9509-1. PMC 4860130. PMID 26685864.
  3. ^ He C, Bonasio R (February 2017). "A cut above". eLife. 6. doi:10.7554/eLife.25000. PMC 5310838. PMID 28199181.
  4. ^ a b c Skene PJ, Henikoff S (January 2017). "An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites". eLife. 6. doi:10.7554/eLife.21856. PMC 5310842. PMID 28079019.
  5. ^ "Lay off the ChIPs: CUT&RUN instead". Fred Hutchinson Cancer Research Center. 20 February 2017.
  6. ^ "Still Using ChIP? Try CUT&RUN for Enhanced Chromatin Profiling". EpiCypher. Retrieved 2019-07-26.
  7. ^ Janssens, Derek; Henikoff, Steven. "CUT&RUN: Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers v3 (protocols.io.zcpf2vn)". protocols.io. doi:10.17504/protocols.io.zcpf2vn.
  8. ^ Ahmad, Kami. "CUT&RUN with Drosophila tissues v1 (protocols.io.umfeu3n)". protocols.io. doi:10.17504/protocols.io.umfeu3n.
  9. ^ Janssens, Derek; Ahmad, Kami; Henikoff, Steven. "AutoCUT&RUN: genome-wide profiling of chromatin proteins in a 96 well format on a Biomek v1 (protocols.io.ufeetje)". protocols.io. doi:10.17504/protocols.io.ufeetje.
  10. ^ antibodies-online. "Bench top CUT&RUN with antibodies-online CUT&RUN Sets (protocols.io.bdwni7de)". protocols.io. doi:10.17504/protocols.io.bdwni7de.
  11. ^ Huang P, Keller CA, Giardine B, Grevet JD, Davies JO, Hughes JR, Kurita R, Nakamura Y, Hardison RC, Blobel GA (August 2017). "Comparative analysis of three-dimensional chromosomal architecture identifies a novel fetal hemoglobin regulatory element". Genes & Development. 31 (16): 1704–1713. doi:10.1101/gad.303461.117. PMC 5647940. PMID 28916711.
  12. ^ Liu N, Hargreaves VV, Zhu Q, Kurland JV, Hong J, Kim W, Sher F, Macias-Trevino C, Rogers JM, Kurita R, Nakamura Y, Yuan GC, Bauer DE, Xu J, Bulyk ML, Orkin SH (April 2018). "Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch". Cell. 173 (2): 430–442.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.03.016. PMC 5889339. PMID 29606353.
  13. ^ Ramachandran S, Ahmad K, Henikoff S (December 2017). "Transcription and Remodeling Produce Asymmetrically Unwrapped Nucleosomal Intermediates". Molecular Cell. 68 (6): 1038–1053.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.11.015. PMC 6421108. PMID 29225036.
  14. ^ Kasinathan S, Henikoff S (April 2017). "Non-B-Form DNA Is Enriched at Centromeres". Molecular Biology and Evolution. 35 (4): 949–962. doi:10.1093/molbev/msy010. PMC 5889037. PMID 29365169.
  15. ^ Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE, Nusbaum C, Myers RM, Brown M, Li W, Liu XS (2008). "Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS)". Genome Biology. 9 (9): R137. doi:10.1186/gb-2008-9-9-r137. PMC 2592715. PMID 18798982.
  16. ^ Meers MP, Tenenbaum D, Henikoff S (July 2019). "Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling". Epigenetics & Chromatin. 12 (1): 42. doi:10.1186/s13072-019-0287-4. PMC 6624997. PMID 31300027.
  17. ^ Bailey T, Krajewski P, Ladunga I, Lefebvre C, Li Q, Liu T, Madrigal P, Taslim C, Zhang J (2013). "Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data". PLoS Computational Biology. 9 (11): e1003326. Bibcode:2013PLSCB...9E3326B. doi:10.1371/journal.pcbi.1003326. PMC 3828144. PMID 24244136.