TCP-seq

TCP-seq

번역 복합 프로파일 순서(TCP-seq)는 메신저 RNA(mRNA) 체인을 따라 단백질 합성 복합체가 순간적으로 분포하는 스냅샷을 얻기 위한 분자생물학 방법이다.[1]null

적용

모든 생명체 형태의 유전자 코드의 표현은 DNA에 기록된 유전자 코드의 복제본을 mRNA의 형태로 합성하는 것과 단백질 합성 그 자체(번역) 두 가지 주요 과정으로 구성되며, 여기서 mRNA의 코드 복사본은 각각의 단백질의 아미노산 시퀀스로 해독된다.필사과 번역은 모두 살아있는 세포에서 일어나는 모든 것(그리고 결과적으로 다세포 유기체)을 근본적으로 통제하는 매우 규제적인 과정이다.null

번역의 통제는 특히 진핵 세포에서 그것이 유전자 발현의 변환 후 규제 네트워크의 일부를 형성하는 데 중요하다.이러한 추가적인 기능성은 번역 과정의 복잡성이 증가함에 반영되어 조사하기 어려운 대상이 된다.그러나 언제 그리고 어떤 mRNA가 번역되고 어떤 메커니즘이 이 제어에 책임이 있는지에 대한 자세한 내용은 정상 및 병리학적 세포 기능을 이해하는 데 핵심적이다.TCP-seq를 사용하여 이 정보를 얻을 수 있다.null

원칙

고투과 DNA와 RNA 시퀀스 식별 방법(Illumina sequenceing 등)의 출현과 함께 비교적 짧은 DNA와 RNA 파편의 대량의 뉴클레오티드 시퀀스를 효율적으로 분석할 수 있게 되었다.이 조각들의 배열은 그 근원을 재구성하기 위해 중첩될 수 있다.또는 소스 시퀀스가 이미 알려진 경우 그 안에서 파편("매핑")을 찾을 수 있으며, 개별 번호가 카운트된다.따라서 파편이 차등적으로 존재하거나 선택("강화")되는 초기 단계가 존재하는 경우, 이 접근법을 사용하여 입력 시퀀스의 매우 큰 수나 길이에 걸쳐 그러한 단계를 정량적으로 설명할 수 있으며, 대부분 세포의 전체 DNA 또는 RNA를 포괄한다.null

TCP-seq는 고투과 RNA 염기서열의 이러한 능력에 기초하고 있으며, 나아가 핵산 보호 현상을 이용한다.보호는 다른 생체 분자와 밀접하게 결합되거나 흡수되는 핵산(특히, RNA)의 연장 또는 탈고성에 대한 저항으로 나타나며, 따라서 핵산 가닥 위로 "발자국"이 남는다.따라서 이러한 "발자국" 조각은 상호작용이 발생하는 핵산 체인의 위치를 나타낸다.파편을 다시 소스 시퀀스에 배열하고 매핑함으로써 이러한 분자간 접촉의 위치와 계수를 정밀하게 식별할 수 있다.null

TCP-seq의 경우, mRNA와 상호작용을 하는 리보솜과 리보솜 하위유닛은 먼저 포름알데히드와 화학적으로 교차하여 기존 상호작용 상태("분포의 스냅샷")를 보존하고 가능한 모든 비균형 프로세스를 차단한다.교차 링크는 살아있는 세포 안에서 직접 수행될 수 있지만, 제한되지는 않는다.RNA는 리보솜이나 리보솜 서브유닛으로 보호되는 파편만 남도록 부분 분해(예: 리보누클리스타)된다.그런 다음, 보호되는 파편들은 부착된 리보솜이나 리보솜 서브유닛의 침전역학에 따라 정제되고, 차단 해제, 시퀀싱 및 소스 transcriptom에 매핑되어 mRNA를 통해 번역단지의 원래 위치를 제공한다.

TCP-seq는 그 종류에 대한 다른 전사적 분석에서 일반적인 몇 가지 요소를 병합한다.특히, 폴리 일부[2][3] 프로파일링과 리보솜(번역) 프로파일링[4] 접근방식도 채택하여, 그에 상응하여 대본의 코딩 영역보다 리보솜이 길어지는 위치 및 폴리 일부 형성에 관여하는 mRNA를 식별한다.그러나 이러한 방법들은 살아있는 세포로부터 공칭 결합 매개체의 정화 및 번역 복합체의 화학적 안정화를 사용하지 않는다.따라서 TCP-seq는 Chip-seq의 기능적 등가물로서, 번역에 적용 가능하도록 재설계된 DNA의 순간적 상호작용을 조사하는 유사한 방법으로 더 간주될 수 있다.null

장단점

이 방법의 장점은 다음과 같다.

  • 독특하게 넓은 시야(작은 리보솜 하위 유니트 스캔을 포함한 모든 유형의 번역 콤플렉스가 처음으로 포착되기 때문)
  • 복잡한 역학을 보다 자연스럽게 표현할 수 있는 가능성(선택된 것뿐만 아니라 모든 번역 과정이 포름알데히드 고정 작업에 의해 구속되기 때문)
  • 번역 복합체 위치의 보다 충실하고/또는 민감하게 감지할 수 있음(공칭 고정으로 리보솜이나 그 하위 유니트에서 파편이 분리되는 것을 방지함).

단점은 다음과 같다.

  • (번역된 mRNA의 초기 격리 및 리보솜과 리보솜 하위 단위를 분리하기 위한 준비 침전물의 요구로 인해) 실험 절차의 전반적인 복잡성 증가;
  • 리보솜 RNA의 원하지 않는 파편(보호된 RNA 파편에 사용되는 넓은 크기 선택 창에서 상속됨)으로 유용한 시퀀싱 읽기 깊이의 높은 오염
  • 각 새 셀 또는 검체 유형에 대한 포름알데히드 고정 절차의 최적화를 위한 사전 검사(최적 포름알데히드 고정 타이밍은 검체 형태학에 크게 의존하며 과다 및 과소 고정 모두 결과를 손상시킨다).

개발

이 방법은 현재 개발 중에 있으며 살아있는 효모세포의 번역역학을 조사하기 위해 적용되었으며, 단순히 이전 기법의 능력을 결합하는 것이 아니라 확장하고 있다.[1]뉴클레오티드 정밀도로 mRNA를 통해 리보솜 위치를 매핑하는 유일한 다른 대본적 방법은 리보솜(번역) 프로파일링이다.다만 길어지는 리보솜의 위치만 포착하고, 개시 단계에서 가장 역동적이고 기능적으로 중요한 번역 매개체는 검출되지 않는다.null

TCP-seq는 이러한 사각지대를 특별히 겨냥하도록 설계되었다.본질적으로 리보솜(번역) 프로파일링과 동일한 수준의 신장 단계에 대한 세부사항을 제공할 수 있지만, 또한 리보솜이나 그 하위유닛이 단백질 합성물의 mRNA와 접촉하고 보호하는 한, 시작, 종료 및 재활용 매개체(기본적으로 다른 가능한 번역 복합체)의 기록도 포함한다.이전에는 손이 닿지 않았던 s.따라서, TCP-seq는 생물학적 샘플의 번역 과정에 대한 완전한 통찰력을 위한 단일 접근방식을 제공한다.번역 개시 중 mRNA에 대한 리보솜 스캐닝의 역학관계는 일반적으로 대부분의 생애 동안 알려져 있지 않기 때문에 이 방법의 특별한 측면은 더욱 발전할 것으로 기대할 수 있다.변환 개시를 위한 TCP-seq 데이터를 포함하는 현재의 데이터 집합은 효모 사카로마이오스 세레비시에 사용할 수 있으며,[5][6] 향후 다른 유기체에 대해 확장될 가능성이 있다.null

참조

  1. ^ a b Archer, Stuart K.; Shirokikh, Nikolay E.; Beilharz, Traude H.; Preiss, Thomas (2016-07-20). "Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling". Nature. 535 (7613): 570–4. Bibcode:2016Natur.535..570A. doi:10.1038/nature18647. ISSN 1476-4687. PMID 27437580. S2CID 4464952.
  2. ^ Mašek, Tomáš; Valášek, Leoš; Pospíšek, Martin (2011-01-01). Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. Vol. 703. pp. 293–309. doi:10.1007/978-1-59745-248-9_20. ISBN 978-1-58829-913-0. ISSN 1940-6029. PMID 21125498.
  3. ^ Spangenberg, Lucia; Shigunov, Patricia; Abud, Ana Paula R.; Cofré, Axel R.; Stimamiglio, Marco A.; Kuligovski, Crisciele; Zych, Jaiesa; Schittini, Andressa V.; Costa, Alexandre Dias Tavares (2013-09-01). "Polysome profiling shows extensive posttranscriptional regulation during human adipocyte stem cell differentiation into adipocytes". Stem Cell Research. 11 (2): 902–912. doi:10.1016/j.scr.2013.06.002. ISSN 1876-7753. PMID 23845413.
  4. ^ Ingolia, Nicholas T.; Ghaemmaghami, Sina; Newman, John R. S.; Weissman, Jonathan S. (2009-04-10). "Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling". Science. 324 (5924): 218–223. Bibcode:2009Sci...324..218I. doi:10.1126/science.1168978. ISSN 1095-9203. PMC 2746483. PMID 19213877.
  5. ^ "TCP-seq data browser".
  6. ^ "GWIPS-viz translation data browser".