드립섹

DRIP-seq

DRIP-seq(DRIP-seq, DRIP-sequencing)는 "R-루프"라고 불리는 DNA-RNA 하이브리드의 유전체 전반에 걸친 프로파일링을 위한 기술이다.[1]DRIP-seq는 DNA-RNA 면역복구(DRIP)를 위한 시퀀스 독립적이지만 구조적인 항체를 활용하여 대규모 병렬 DNA 염기서열을 위한 R-루프를 포착한다.[1]null

소개

R-루프 및 S9.6 단클론 항체

R-루프는 세 가닥의 핵산 구조로, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 및 교체된 단일 좌초 DNA(ssDNA)로 구성된다.[2]R-루프는 주로 전사[2] 과정에서 시토신이 풍부한 유전체 부위에서 형성되며 유전자 발현과 면역글로불린 등급 전환에 관여하는 것으로 알려져 있다.[1][3][4]그들은 박테리아에서 포유류에 이르는 다양한 종에서 발견되었다.[2]인간 세포의 CpG 섬 프로모터, 효모에 고도로 표기된 지역에서 우선적으로 국산화된다.[1][3]null

DNA-RNA 하이브리드의 높은 생산량이라는 비정상적인 조건 하에서, R-루프는 단일 가닥 DNA를 AID와 APOBEC와 같은 효소의 작용에 의해 발휘되는 내생적 손상에 노출시키거나 화학적으로 반응하는 종에 과도하게 노출시킴으로써 게놈의 불안정성을 야기시킬 수 있다.[4]따라서 게놈 전체에 걸쳐 어디서 어떤 상황에서 R-루프가 형성되는지를 이해하는 것은 게놈 불안정성에 대한 더 나은 이해를 위해 매우 중요하다.R-루프 특성화는 처음에는 특정 접근방식에 국한되었다.[5]그러나 DRIP-seq와 같은 대규모 병렬 시퀀싱 기술과 그 이후 파생 모델이 등장하면서 R-루프용 게놈 전체를 조사할 가능성이 열렸다.null

DRIP-seq는 다양한 길이의 DNA-RNA 하이브리드에 대한 S9.6 단클론 항체(mAb)의 높은 특수성과 친화력에 의존한다.S9.6 mAb는 1986년에 처음 만들어졌으며, 현재 R-루프의 선택적 면역복제에 사용되고 있다.[6]이후 R루프 특성화를 위해 다양한 면역복구방법에 이용되었다.[1][3][7][8]DRIP-seq 이면의 개념은 Chip-sequencing과 유사하며, R-루프 조각은 DRIP-seq의 주요 면역억제 물질이다.null

사용 및 현재 연구

DRIP-seq는 주로 R-루프의 게놈 범위 매핑에 사용된다.R-루프 형성현장을 식별하면 특정 지역의 R-루프 형성의 기능, 이들 영역의 특성화, 유전자 발현에 미치는 영향 등 다양한 세포 사건을 연구할 수 있다.그것은 또한 DNA 복제와 합성과 같은 다른 과정에서 R-루프의 영향을 연구하는데 사용될 수 있다.간접적으로 DRIP-seq는 R-루프 분해능과 관련된 유전자가 결핍된 돌연변이 세포 라인에 대해 수행될 수 있다.[3]이러한 유형의 연구는 DNA-RNA 형성을 억제하는 돌연변이 유전자의 역할과 게놈 불안정성에 대한 R-루프의 중요성에 대한 정보를 제공한다.null

DRIP-seq는 인간 내 R-루프의 게놈 전반 프로파일링에 처음 사용되었는데, CpG 섬 프로모터에서는 R-루프 형성이 광범위하게 나타났다.[1]특히 연구진은 R-루프 형성이 CpG섬의 비메틸화 상태와 관련이 있다는 사실을 밝혀냈다.null

DRIP-seq는 후에 인간의 전지전능한 Ntera2 세포의 전사 시작 지점과 종료 지점에서 R-루프 형성을 프로파일링하기 위해 사용되었다.[7]이 연구에서, 연구원들은 3개의 유전자의 끝에 있는 R-루프는 전사 종식과 상관관계가 있을 수 있다는 것을 밝혔다.null

DIP-seq의 워크플로우

DIP-seq의 워크플로우

유전체 DNA 추출

먼저 단백분해효소 K 치료로 관심 세포에서 유전체 DNA(genomic dna, gDNA)를 추출한 후 페놀-클로로폼 추출과 에탄올 침전물을 투여한다.단백질 분해효소 K 치료 전에 효모세포가 세포벽을 제거하기 위해서는 추가적인 zymolyase 소화가 필요하다. gDNA는 칼럼 기반 방법 등 다양한 방법으로도 추출할 수 있다.null

유전체 DNA 조각화

GDNA는 원치 않는 ssDNA와 RNA를 제거하기 위해 S1 누클레스로 처리되며, 이어 에탄올 침전물이 S1 누클레스를 제거한다.그 후 gDNA는 제한 엔도뉴클레스로 파편화되어 크기가 다른 이중 가닥 DNA(dsDNA) 파편이 나온다.또는 소음에 의해 gDNA 파편이 생성될 수 있다.null

면역복구

조각난 gDNA는 DNA-RNA 구조별 S9.6mAb와 배양된다.이 단계는 전적으로 DNA-RNA 하이브리드에 대한 S9.6 mAb의 높은 특수성과 친화력에 의존하기 때문에 DRIP-seq 프로토콜의 경우 독특하다.항체는 게놈에 분산된 이러한 영역을 인식하고 결합할 것이며 면역복귀에 사용될 것이다.S9.6 항체는 구슬 표면의 특정 리간드(즉 단백질 A 또는 단백질 G)와 상호작용하여 자성 구슬에 결합된다.따라서, 파편이 포함된 DNA-RNA는 항체를 통해 구슬에 결합될 것이다.null

용출

자석 구슬은 일련의 세척에 의해 구슬에 묶이지 않은 gDNA를 제거하기 위해 세척되고 DNA-RNA 하이브리드는 용출에 의해 회수된다.핵산 하이브리드에 묶인 항체를 제거하기 위해 단백질 분해효소 K 처리를 한 후 페놀-클로로폼 추출과 에탄올 침전 등을 수행한다.이것은 크기가 다른 정제된 DNA-RNA 하이브리드를 격리시키는 결과를 낳는다.null

시퀀싱

이러한 단편들의 대규모 병렬 염기서열 분석을 위해 면역억제 물질은 소닉화되며, 클러스터 농축 및 염기서열을 위해 바코딩된 올리고뉴클레오티드 어댑터에 크기가 선택되고 결합된다.null

컴퓨터 분석

R-루프 형성 부위를 검출하기 위해 DIP-seq의 수억 개의 시퀀싱 판독값을 먼저 짧은 판독 시퀀스 얼라이너와 함께 참조 게놈에 맞춰 배열한 다음, Chip-seq를 위해 설계된 피크 호출 방법을 사용하여 DRIP 신호를 평가할 수 있다.[1]동일한 샘플의 서로 다른 DIP-seq 실험에 서로 다른 제한 효소의 칵테일을 사용했다면, 컨센서스 DIP-seq 피크가 호출된다.[7]일반적으로 피크는 입력 제어의 역할을 하는 해당 RNase H1 처리 샘플의 피크와 비교된다.[1][7]null

제한 사항

또 다른 R루프 면역집중화 항체 기반 방법이 없어 DRIP-seq 결과 검증이 어렵다.그러나 DRIVE-seq와 같은 다른 R-루프 프로파일링 방법의 결과는 합의점을 측정하기 위해 사용될 수 있다.null

반면 DRIP-seq는 R-루프 시퀀싱을 위해 기존의 짧은 읽기 시퀀싱 플랫폼에 의존한다.즉, 이러한 플랫폼의 모든 내재적 제한은 DRIP-seq에도 적용된다.특히, 일반적인 짧은 읽기 시퀀싱 플랫폼은 GC가 풍부한 지역에서 불균일한 읽기 커버리지(read coverage)를 산출할 것이다.R-루프는 주로 시토신이 풍부한 DNA 영역에서 형성되기 때문에 긴 R-루프 염기서열은 어려움을 겪을 수 있다.더욱이 GC가 풍부한 지역은 특성상 복잡도가 낮은 경향이 있어 짧은 읽기 얼라이너로는 고유한 얼라이너를 만들기 어렵다.null

기타 R-루프 프로파일링 방법

R-루프 형성의 분석과 프로파일링을 위한 몇 가지 다른 방법이 있지만,[5][9][10][11][12][13][14][15][16] 게놈 전체 규모에서 커버리지와 강건성을 제공하는 것은 거의 없다.[1][3]null

  • 비거부 비황산염 수정 및 염기서열:이 방법은 염기서열에 따른 비황산염 처리로 구성되며 ssDNA에 대한 비황산나트륨의 돌연변이 유발 효과에 의존한다.이 방법은 주로 특정 CpG 섬 프로모터의 현지화에 사용되지만,[1] 소규모의[5] R-루프 및 기타 ssDNA 취약 지점의 탐지에 사용되었다.[17]
  • DNA:RNA 체외 농축(DRIVE-seq):[1]이 방법은 R-루프 회수를 위해 S9.6mAb 대신 MBP-RNAEH1 엔도누클리스(endonuclease)를 사용하는 것을 제외하고 DIP-seq와 매우 유사한 원리를 공유한다.MBP-RNASEH1은 추가 포획 검사가 필요할 때 S9.6mAb에 대한 대안을 제공하지만, 이 내분비체의 과다 표현은 체내 세포독성 위험을 초래할 수 있다.
  • DNA:RNA 불초기화 후 타일링 마이크로어레이(DRIP-칩):[3]이 방법은 또한 S9.6 mAb의 사용에 의존한다.단, 시퀀싱 파이프라인에 들어가는 대신 DIP칩의 면역억제물질은 마이크로 어레이로 하이브리드화된다.DIP-seq에 비해 DIP-칩의 장점은 데이터의 빠른 둔감이다.이 기술의 제한 요인은 칩 마이크로레이에 대한 탐침 수와 DNA 시퀀스 정보의 부재다.

참고 항목

참조

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