광학 단면도

광학 단면술은 적절히 설계된 현미경이 두꺼운 표본의 깊은 곳에 있는 초점 평면의 선명한 이미지를 만들어 낼 수 있는 과정이다.이는 마이크로톰과 같은 기구를 사용하여 얇은 단면화의 필요성을 줄이기 위해 사용된다.광학 단면술에는 여러 가지 다른 기법이 사용되며, 광학 단면술의 품질을 개선하기 위해 몇 가지 현미경 기법이 특별히 설계되어 있다.

흔히 좋은 깊이 또는 z 해상도로 불리는 좋은 광학 단면화는 다른 초점면에서 포착된 이미지에서 샘플의 3차원 재구성을 가능하게 하기 때문에 현대 현미경 검사에서 인기가 있다.

전통적인 광현미경의 광학적 단면도

이상적인 현미경에서는 초점면에서 나오는 빛만 검출기(일반적으로 관찰자 또는 CCD)에 도달하여 현미경이 초점을 맞춘 샘플 평면의 선명한 이미지를 생성할 수 있다.불행히도 현미경은 이렇게 구체적이지 않고 초점면 밖의 선원에서 나오는 빛도 검출기에 도달한다; 두꺼운 표본에서는 초점면과 목표 렌즈 사이에 상당한 양의 물질과 가짜 신호가 있을 수 있다.

현미경을 수정하지 않는 경우, 즉 단순한 광전광 현미경으로 광학 단면화의 품질은 사진에서 광전 효과의 깊이와 동일한 물리학에 의해 좌우된다.넓은 개구부에 해당하는 높은 숫자의 애퍼처 렌즈의 경우, 필드 깊이가 작으며(허용 초점) 광학 단면화가 잘 된다.고배율 목표 렌즈는 일반적으로 저배율 목표보다 더 높은 숫자 개구부(그래서 더 좋은 광학 단면도)를 가진다.오일 흡수 목표는 일반적으로 훨씬 더 큰 숫자 구멍을 가지고 있어서 광학 단면화가 개선된다.

표준 광폭장 현미경의 깊이 방향("z 해상도")에서의 분해능은 빛의 파장과 숫자 구멍에 따라 달라지며, 다음과 같이 근사하게 추정할 수 있다.

${\displaystyle D_{}}$ ${\displaystyle z_{}}$= ${\displaystyle \frac{\mathrm{\lambda n}}{}}$(${\displaystyle \frac{\mathrm{NA}{}^{}}{}}$) ${\displaystyle \frac{{2\mathrm{}}^{}}{}}$ ${\$ n$}{{}{{(\mathrm{NA} )^{2$}} 여기서$$ λ은 파장, n은 목표 렌즈 몰입 매체의 굴절률, NA는 숫자 조리개이다.^[2]

이에 비해 측면 분해능은 다음과 같이 근사할 수 있다.^[3]

${\displaystyle D_{x}=D_{y}={\frac {0.61\lambda }{\mathrm {NA}}}}}$

광학 단면 개선 기법

광원경 현미경

수적 간극의 증가를 넘어, 밝은 영역 광현미경 검사에서 광학 단면을 개선할 수 있는 기술은 거의 없다.기름침입 목표를 가진 대부분의 현미경은 굴절 한계로 인해 가능한 수학적 구간의 한계에 도달하고 있다.

차동 간섭 대비(DIC)는 광학 단면도를 다소 개선해 준다.DIC에서 샘플은 두 소스의 위상 차이로 인한 영상을 생성하는 데 방해가 되는 두 개의 약간 오프셋된 광원에 의해 효과적으로 조명된다.광원의 간격띄우기가 작기 때문에 초점 평면에 가까운 재료에서 위상의 유일한 차이가 발생한다.

형광 현미경

형광 현미경 검사에서 초점 평면에서 벗어난 물체는 조명되고 형광 투시되는 경우에만 이미지를 방해한다.이것은 초점면에만 특정한 조도를 만들어 광학 단면화를 개선할 수 있는 추가적인 방법을 추가한다.

공초점 현미경 검사는 검체를 비추기 위해 스캔 지점이나 빛의 지점을 사용한다.이것은 결합 초점 평면의 핀홀과 함께 광학 단면화를 개선하기 위해 초점 평면 외부의 광원에서 빛을 걸러내는 작용을 한다.^[4]

광시트에 기반한 형광 현미경 검사는 관찰 방향에 대해 90° 각도로 흥분광으로 샘플을 조명한다. 즉, 초점면만 한 방향(광시트)에만 초점을 맞춘 레이저를 사용하여 조명한다.^[5]이 방법은 효과적으로 초점이 맞지 않는 빛을 감소시키고 또한 에피 형광 현미경 검사에 비해 종방향 분해능이 다소 개선될 수 있다.

이중 및 다중 광자 흥분 기술은 불소자가 정확한 에너지의 단일 광자뿐 아니라 여러 광자에 의해서도 흥분할 수 있다는 점을 이용하는데, 이것은 함께 정확한 에너지를 제공한다.복수의 광자가 불소포체와 동시에 상호작용하도록 요구하는 추가적인 "집중" 의존적 효과는 초점면에 매우 가까운 자극만 준다.이 기법들은 보통 콘코칼로컬 현미경 검사와 함께 사용된다.^[6]

광학 단면화의 추가적인 개선은 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 개선은 주로 빛의 회절 한계를 우회하는 방법을 통해 이루어진다.예를 들어, 단일^[7] 불소포자 및 3차원 구조 조명 현미경 검사에 대한 매우 정확한 깊이 정보를 제공하기 위해 두 개의 객관적인 렌즈를 통한 단일 광자 간섭측정법이 포함된다.^[8]

측정되거나 계산된 포인트 확산 기능에 따라 이미지에서 흐림을 제거하는 영상 처리 기술인 디콘볼루션(deconvolution)을 통해 일반 광장 현미경의 광학 단면을 크게 개선할 수 있다.^[9]

에이전트 지우기

시료를 투명하게 만들어 내부 구조를 관찰할 수 있도록 하는 벤질-알코올/벤질 벤조아테(BB) 또는 벤질^[10] 에더와 같이 굴절률(>1.4)이 높은 클리어제를 사용하면 광학 단면화를 향상시킬 수 있다.

기타

광학 단면화는 비광현미경에서 낙후되어 있다.^{[citation needed]}

X선과 전자현미경은 전형적으로 장내 깊이가 크기 때문에(광학구획이 잘 안됨) 표본의 얇은 단면이 여전히 널리 사용되고 있다.

비록 유사한 물리학이 초점 과정을 안내하지만,^[11] 이러한 현미경들은 단지 샘플의 표면과 상호작용을 하기 때문에 전형적으로 광학 단면화의 맥락에서 논의되지 않는다.

토탈내반사현미경은 형광 현미경 기법으로, 의도적으로 표본의 상단 또는 하단 표면으로 관측을 제한하지만, 매우 높은 깊이 해상도를 가지고 있다.

초점 구획과 틸팅의 조합을 이용한 3D 영상촬영은 대규모 시야에서 탁월한 3D 해상도를 제공하기 위해 이론적, 실험적으로 입증되었다.^[12]

대안

광학 단면화의 주요 대안은 다음과 같다.

• 예를 들어, 이력학에서 사용되는 샘플의 얇은 섹션화.
• 전송 전자현미경 검사용으로 특히 잘 개발된 단층 촬영법.

참조