격자형 라이트시트 현미경법

Lattice light-sheet microscopy

격자형광시트현미경은 광독성으로 인한 세포 손상을 줄이면서 이미지 획득 속도를 높이는 광시트형광현미경법 수정판이다.이는 구조화된 라이트 시트를 사용하여 연속적인 검체 평면에서 형광을 자극하고 동적 생물학적 과정에 [1][2]대한 정보를 제공할 수 있는 시계열 3D 영상을 생성함으로써 달성됩니다.

그것은 2010년대 초에 Eric Betzig에 의해 개발되었다.워싱턴포스트(WP)에 따르면 에릭 베치그는 이 같은 연구 결과가 2014년 노벨화학상을 받은 초해상도 형광현미경 [3]연구보다 더 큰 영향을 미칠 것으로 보고 있다.

Ratis 라이트 시트 형광 현미경법 설정

Optical path of a lattice light sheet microscope
(일부) 레이저선과 AOTF, b로부터의 격자광시계 현미경의 광로.x 원통 렌즈, (c) z 원통 렌즈, (d)SLM, (e). 고리형 마스크, (f.) z 및 x galvos, (g)(h) 관찰 목적 (i) EMCCD 카메라에 대한 여진 목적.inset: 목표를 확대합니다.

격자형광시트현미경법은 라이트시트형광현미경법, 베셀빔현미경법 및 초해상도현미경법(특히 구조화된 조명현미경법, SIM[4])의 새로운 조합입니다.

격자형 라이트시트 현미경법에서는 라이트시트 현미경과 매우 유사하게 샘플의 조명은 화상검출에 수직으로 발생한다.처음에 광시트는 x축을 따라 한 쌍의 원통형 렌즈로 직선 편광 원형 입력빔을 연장한 후 z축을 따라 [5]다른 한 쌍의 렌즈로 압축함으로써 형성된다.이 변경에 의해 얇은 빛의 시트가 생성되어 바이너리 강유전체 공간광변조기(SLM)에 투사됩니다.SLM은 광선의 파형을 공간적으로 변화시키는 장치입니다.SLM에서 반사된 빛은 불필요한 회절을 제거하기 위해 사용됩니다.투명한 [5]고리를 포함한 불투명 마스크에서 반사광으로부터 프라운호퍼 회절 패턴을 생성하는 트랜스폼 렌즈에 의해 회절을 제거한다.광학 격자는 2차원 또는 3차원 간섭 패턴으로, 여기서 투명한 고리 모양의 링에 의해 생성됩니다.마스크는 x 및 z 검류계에 공역합니다.이 현미경의 품질은 조명 시트가 x축 내에서 진동해야 하는 디더링된 작동 모드에 중요합니다.

격자형 라이트 시트 현미경에는 두 가지 작동 모드가 있습니다.디더링 모드에서는, 광시트가 x축을 따라서 신속히 주사되어 통상 회절 제한 해상도로 [1]Z평면 마다 1개의 화상만이 기록된다.두 번째 작동 모드는 구조화된 조명 현미경 모드(SIM)입니다. SIM은 여기광의 격자 패턴을 샘플에 중첩하여 각 이미지 [6][7][8]캡처 간에 단계적으로 회전시키는 기술입니다.그런 다음 이러한 이미지는 알고리즘을 통해 처리되어 광학 기기에 내장된 회절 한계를 초과하여 재구성된 이미지를 생성합니다.

이론.

Theory behind lattice light sheet microscopy
파괴적으로 간섭하는 베셀 빔의 격자. (a) 두 베셀 빔 사이의 파괴적(위) 및 건설적(아래) 간섭 패턴의 도식.두 중심 사이의 링이 어떻게 감쇠/증폭되는지 주목하십시오. (b) 베셀 빔의 간섭에 의해 생성된 2D 광학 격자의 간섭 패턴.inset: 간섭 전에 하나의 베셀 함수, (c)-왼쪽: SLM 매개 격자 하위 패턴 선택, 빨간색: SLM 픽셀 꺼짐, -오른쪽: 샘플에서 입사 빔 보기(x 방향으로 빔을 디더링한 후), (d).베셀 함수(왼쪽)와 푸리에 영역에서의 강도(오른쪽) 및 고리(인셋), (e). 베셀 빔 배열의 푸리에 평면에서의 강도(왼쪽) 및 대상 평면에서의 강도(오른쪽)입니다.

격자 라이트 시트 현미경은 축 분해능(z 단위 분해능이라고도 함) 측면에서 베셀 빔 라이트 시트 현미경의[9] 향상으로 볼 수 있습니다.베셀빔 라이트시트 현미경에서는 먼저 비회절 베셀빔을 생성하여 x방향으로 다이더링하여 시트를 생성한다.그러나 베셀 함수의 로브는 중심 지점만큼 많은 에너지를 전달하므로 관측 목표의 장 깊이를 벗어난 조도가 발생한다.

격자형 라이트시트 현미경은 파괴적 간섭에 의해 베셀 기능의 외엽의 강도를 감소시키는 것을 목적으로 한다.이를 위해 정기적으로 간격을 둔 Bessel 빔의 2차원 격자가 작성됩니다.그런 다음 보 사이의 간격(즉, 격자의 주기)을 신중하게 조정하여 파괴 간섭을 트리거할 수 있습니다.

실질적으로 간섭하는 베셀빔의 격자는 바이너리 패턴을 표시하기 위해 개별 화소를 온/오프할 수 있는 액정 디바이스인 공간광변조기(SLM)에 의해 설계된다.SLM의 매트릭스 특성상 생성되는 패턴에는 불필요한 주파수가 다수 포함되어 있습니다.따라서 이것들은 물체의 후면 초점 평면(Fourier 도메인)과 공역된 평면에 배치된 환에 의해 걸러진다.

마지막으로 격자보다 시료에서 균일한 강도를 얻기 위해 x방향으로 진동하는 검류계를 사용하여 시트를 디터링한다.

기타 방법의 개선

래티스 라이트 시트 현미경은 광 표백으로 [1]샘플을 손상시키지 않고 높은 해상도와 선명한 이미지를 획득할 수 있습니다.광 표백은 형광 현미경 검사에서 매우 일반적인 주요 문제이며, 형광 태그는 반복된 들뜸에서 광자를 방출하는 능력을 잃습니다.일반적인 형광 현미경과 달리, Ratis Light-Sheet Microscope의 샘플은 기존 기술에 비해 광 표백 속도가 크게 감소합니다(기존 기술에서는 여러 번의 들뜸을 통해 영상 신호가 약해집니다).이것에 의해, 선명도를 저하시키지 않고 장시간 노출이 가능해져, 결과적으로 비디오를 장시간 캡쳐 할 수 있습니다.또한 래티스 방식은 초당 200~1000개의 평면을 촬영할 수 있는 매우 빠른 캡처 속도를 갖추고 있어 관찰 중인 프로세스에 대한 우리의 지식에 차이가 없습니다.이 캡처 속도는 베셀 빔 들뜸보다 1배 빠른 속도이며 스피닝 디스크 공초점 현미경 [1]검사보다 2배 빠른 속도입니다.이 두 가지 장점이 결합되어 연구자들이 오랜 시간에 걸쳐 매우 상세한 영화를 찍을 수 있게 된다.

적용들

격자 라이트 시트 현미경은 생체 내 세포 위치 결정 및 초분해능에 유용합니다.격자 광시트의 제한된 들뜸 띠는 거의 모든 조명된 셀의 초점을 유지합니다.초점이 맞지 않는 큰 스팟의 감소는 고분자 밀도로 개별 세포를 정밀하게 추적할 수 있게 합니다. 이는 이전의 현미경 검사 [1]방법으로는 달성할 수 없는 능력입니다.그 결과 격자 라이트시트가 다수의 동적 셀 상호작용에 사용되고 있다.광독성의 감소는 살아있는 조직을 손상시키지 않고 배아의 세포하 과정을 연구할 기회를 만들어냈다.연구는 유사분열 내내 미세관의 매우 가변적인 성장 패턴의 범위를 조사하고 정량화했다.Dictyostelium discoideum(슬림 곰팡이) 세포는 서로에 대한 빠른 주화학적 움직임과 초기 접촉 중에 이미징되었습니다.

면역학적 시냅스의 후속 형성과 함께 T세포와 표적세포의 집적이 관찰되었다.격자 시트법의 진보로 액틴의 입체적인 움직임 패턴과 이러한 상호작용에서의 편모상돌기가 밝혀졌다.영상 속도의 증가는 또한 다른 연구에서 세포 외 기질을 통해 빠르게 움직이는 호중구를 관찰할 수 있게 했다.

제한 사항

격자형 라이트 시트 현미경 검사는 양호한 영상 품질을 달성하기 위해 투명한 샘플과 얇은 샘플로 제한됩니다.획득된 이미지의 품질은 이미지가 촬영된 샘플 내에서 더 깊이 있을수록 저하됩니다.이 현상은 검체유발수차로 인해 발생하며, 20~100μm 이상의 영상샘플에는 [1]적응광학이 필요하다고 제안되어 왔다.

결의안

  • SIM: 150 nm x 230 nm xy 해상도, 280 nm z 해상도
  • 다이더드: 230 nm xy 해상도, 최대 370 nm z 해상도

대비

  • 들뜸 대역은 폭이 1.0미크론 이하이고, 검출 대상의 초점 깊이는 1.1미크론 이하이기 때문에 조명된 분자의 대부분은 초점면에 있다.

샘플의 깊이

  • 격자 라이트 시트와 적응형 광학 장치를 조합하여 깊이 20-100미크론 이상의 이미징이 가능할 수 있습니다.

장래의 일

이 기술은 하워드 휴즈 의학 [10]연구소의 자넬리아 연구 캠퍼스에서 활발하게 개발되고 있다.Eric Betzig는 그의 목표가 "생물 시스템 [3]내부를 깊이 들여다볼 수 있는 고속, 고해상도, 저영향 도구"를 개발하기 위해 현미경 연구에 대한 그의 작업을 결합하는 것이라고 말했다.격자 라이트시트 현미경과 적응광학법을 조합하여 20~[1]100μm 이상의 투과율을 달성할 수 있다.

시판되는 현미경


레퍼런스

  1. ^ a b c d e f g Chen, B.-C.; Legant, W. R.; Wang, K.; Shao, L.; Milkie, D. E.; Davidson, M. W.; Janetopoulos, C.; Wu, X. S.; Hammer, J. A.; Liu, Z.; English, B. P.; Mimori-Kiyosue, Y.; Romero, D. P.; Ritter, A. T.; Lippincott-Schwartz, J.; Fritz-Laylin, L.; Mullins, R. D.; Mitchell, D. M.; Bembenek, J. N.; Reymann, A.-C.; Bohme, R.; Grill, S. W.; Wang, J. T.; Seydoux, G.; Tulu, U. S.; Kiehart, D. P.; Betzig, E. (23 October 2014). "Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution". Science. 346 (6208): 1257998. doi:10.1126/science.1257998. PMC 4336192. PMID 25342811.
  2. ^ Keely, Jim; Gutnikoff, Robert (23 October 2014). "New Microscope Collects Dynamic Images of the Molecules that Animate Life". HHMI News. Chevy Chase, MD: Howard Hughes Medical Institute. Retrieved 28 October 2014.
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  6. ^ Guerra, John M. (1995-06-26). "Super‐resolution through illumination by diffraction‐born evanescent waves". Applied Physics Letters. 66 (26): 3555–3557. doi:10.1063/1.113814. ISSN 0003-6951.
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  10. ^ Kresge, Nicole. "Microscopes for the Masses". HHMI Bulletin. Howard Hughes Medical Institute. Retrieved 4 September 2015.
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