4Pi 현미경

4Pi 현미경은 향상된 축 분해능을 가진 레이저 주사 형광 현미경입니다.이를 통해 축 분해능의 일반적인 범위인 500~700nm를 100~150nm로 개선할 수 있으며, 이는 표준 공초점 ^[1]현미경법보다 부피가 5~7배 적은 거의 구형의 초점에 해당한다.

작동 원리

해상도의 향상은 두 개의 마주보는 대물 렌즈를 사용하여 달성되며, 두 렌즈는 모두 동일한 기하학적 위치에 초점이 맞춰집니다.또, 2개의 대물렌즈 각각을 통과하는 광로 길이 차이가 최소한으로 되도록 주의 깊게 정렬한다.이것에 의해, 양쪽의 피사체의 공통 초점 영역에 존재하는 분자를 양면에서 일관되게 조명할 수 있어 반사광 또는 발광광을 일관되게 수집할 수 있어 즉, 검출기상의 방사광의 일관 중첩이 가능해진다.조명 및 검출에 사용되는 솔리드 각도$\delta {\displaystyle \mathrm{}}$(\$displaystyle \Omega)$가 증가하여 최대치에 근접합니다.이 경우 샘플이 모든 측면에서 동시에 조명되고 감지됩니다.

그림에 4Pi 현미경의 작동 모드가 나와 있습니다.레이저 빛은 빔 스플리터에 의해 분할되고 거울에 의해 마주보는 두 개의 대물 렌즈로 향합니다.공통 초점에서는 두 집속광 빔의 중첩이 발생합니다.이 위치의 들뜬 분자는 형광광을 방출하고, 두 대물렌즈에 의해 동일한 빔 스플리터에 의해 결합되어 이색 거울에 의해 검출기에 편향된다.두 발광 경로의 중첩이 다시 발생할 수 있습니다.

이상적인 경우 각 대물 렌즈는 $\delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle =}$ ${\displaystyle 2}$ {$디스플레이$스타일 \$Omega = 2\pi$의 고체 각도에서 빛을 모을 수 있습니다. 두 개의 대물 렌즈를 사용하면 모든 방향에서 빛을 모을 수 있습니다(고체 각도 ${\displaystyle \mathrm{\delta }}$ ${\displaystyle =}$ 4$δ$ {디스플레이 $스타일$ \Omega $=$4\$pi$}).$$이런 유형의 현미경 검사는 들뜸과 검출을 위한 최대 가능한 고체 각도에서 유래했습니다.실제로 대물렌즈는 약 140°의 조리개 각도만 얻을 수 있으며, 이는 $\delta {\displaystyle \mathrm{}\mathrm{1\; 1}}$.3 ${\$ \$style$ \ displaystyle \ $Omega$ \ 1$1 .$ 3 \ $pi$ $\}$에 해당한다.

현미경은 세 가지 방법으로 작동할 수 있습니다.A형 4Pi 현미경에서는 들뜸광의 간섭성 중첩을 이용하여 높은 분해능을 생성한다.발광광은 한쪽에서만 감지되거나 양쪽에서 일관되지 않은 중첩 위치에 있습니다.B형 4Pi 현미경은 발광광만 간섭한다.타입 C 모드로 동작하면, 여기광과 발광광이 모두 간섭해, 가능한 한 높은 분해능을 얻을 수 있습니다(공초점 현미경에 비해 광축을 따라서 약 7배).

실제 4Pi 현미경에서는 빛을 모든 방향에서 동일하게 적용하거나 모을 수 없으므로 점 확산 기능에서 소위 사이드 로브가 발생합니다.일반적으로 (항상 그렇지는 않지만) 2광자 들뜸 현미경은 4Pi 현미경과 방출 핀홀을 조합하여 이러한 측면 로브를 허용 가능한 수준으로 낮추기 위해 사용됩니다.

역사

1971년 Christoph Cremer와 Thomas Cremer는 완벽한 홀로그램, 즉 모든 방향의 점 소스 방출에 대한 전체 필드 정보를 전달하는 홀로그램, $이른바{\displaystyle \mathrm{}}$ $(\displaystyle$ 4$\pi)$ ^[2][3]홀로그램의$$ 개발을 제안했다.그러나 1978년 출판물은 부적절한 물리적 결론(즉, 점 같은 빛의 점)을 도출했고, 고체 ^[5]각도의 반대쪽을 추가하는 실제 이점으로서 축 분해능 증가를 완전히 놓쳤다.실용적인 4Pi 현미경 시스템의 첫 번째 설명, 즉 두 개의 마주보는 간섭 렌즈를 가진 설정은 1991년 ^[6]Stefan Hell에 의해 발명되었다.그는 ^[7]1994년에 그것을 실험적으로 증명했다.

그 후 몇 년 동안 이 현미경의 응용 분야 수는 증가했습니다.예를 들어, 향상된 공간 분해능과 동시에 샘플의 64개 지점을 가진 병렬 들뜸 및 검출은 2002년 ^[8]4Pi 현미경으로 효모 세포에서 미토콘드리아의 역학을 성공적으로 기록하는 결과를 낳았다.상업용 버전은 2004년에^[9] 현미경 제조업체인 Leica Microsystems에 의해 출시되었고 이후 중단되었다.

지금까지 4Pi 현미경은 자극 방출 감소(STED) ^[10]원리와 같은 초해상도 기술과 함께 최고의 품질에 도달했습니다.적절한 들뜸과 들뜸 제거 빔이 있는 4Pi 현미경을 사용하여 균일하게 50nm 크기의 스팟을 만들 수 있었다. 이는 고정 세포에서 공초점 현미경 검사와 비교하여 150–200배 감소된 초점 부피에 해당한다.4Pi 현미경과 RESOLFT 현미경의 조합으로, 이제 ^[11]40nm 미만의 등방성 분해능으로 낮은 조도로 살아있는 세포를 촬영할 수 있다.

「 」를 참조해 주세요.

• 자극배출공핍현미경(STED)
• 다초점 평면 현미경 검사(MUM)

레퍼런스