미분원심분리

Differential centrifugation
미분원심분리

미분원심분리(미분속원심분리라고도 함)는 생화학 및 세포생물학에서 매우 일반적인 절차로, 유기체와 기타 아세포 입자의 침전율에 기초하여 분리하는 데 사용된다.생물학적 분석에 자주 적용되지만, 미분원심분리술은 비생물이 부유하는 입자(나노파티클, 콜로이드 입자, 바이러스 등)의 조잡한 정화에 적합한 일반적인 기법이다.세포 생물학적 현상(예: 오르가넬 분포)을 분석하기 위해 차동 원심분리기(differential sepling)를 사용하는 일반적인 경우, 세포막을 부수고 오르가넬과 시토솔을 방출하기 위해 조직 샘플을 먼저 라이스로 처리한다.그런 다음 리세이트는 반복된 원심분리 과정을 거치게 되며, 주어진 시간 동안 주어진 원심력에서 충분히 빠르게 침전된 입자가 원심분리관 바닥에 콤팩트한 "펠릿"을 형성한다.[1]null

각 원심분리 후 상등액(연삭되지 않은 용액)을 튜브에서 제거하고 증가된 원심력 및/또는 시간에 다시 중심화한다.미분원심분리기는 침전율에 근거한 조잡한 분리에 적합하지만 평형밀도-분해성원심분리기를 통한 밀도에 근거하여 더 미세한 분리가 이루어질 수 있다.[2]따라서, 미분원심분리법은 점점 더 높은 원심분리력을 사용하여 이전 초산물의 입자를 연속적으로 펠링하는 것이다.[3]차동 원심분리기로 분리된 셀룰러오넬은 격리 중 변성 조건에 노출되지 않는 한 비교적 높은 수준의 정상 기능을 유지한다.[4][5]null

이론

점성액에서 주어진 부유입자의 침전 속도(입자가 유체보다 밀도가 높은 한)는 대체로 다음과 같은 요인의 함수다.

  • 중력
  • 밀도 차이
  • 유체 점도
  • 입자 크기 및 모양

더 큰 입자는 더 빠르고 낮은 원심력에 침전된다.입자가 액체(예: 물 속의 지방)보다 밀도가 낮으면 입자는 침전물이 아니라 입자가 경험하는 g-력의 강도에 관계없이 떠다닌다.원심력은 밀도뿐만 아니라 입자의 크기와 형태에 근거하여 구성품을 분리한다.이와는 대조적으로 보다 전문화된 평형밀도-분해 원심분리기는 입자밀도에만 의존하는 분리 프로파일을 생성하므로 보다 미세한 분리에 적합하다.null

g-력이 높으면 아주 작은(나노스케일) 입자에 대해서도 브라운 확산보다 작은 입자의 침전 속도가 훨씬 빠르다.원심분리기를 사용할 경우 회전 중심에서 거리에 따른 g-힘의 변동을 설명하도록 스톡스의 법칙을 수정해야 한다.[6]null

어디에

  • D는 침전물이 예상되는 입자의 최소 직경이다(m)
  • η (또는 μ)는 유체 동적 점성(Pa.s)이다.
  • R은f 최종 회전 반지름(m)이다.
  • R은i 초기 회전 반지름(m)이다.
  • ρp 입자 부피 질량 밀도(kg/m3)
  • ρ는f 유체 부피 질량 밀도(kg/m3)
  • Ω은 각도 속도(라디안/s)
  • t는 R에서i Rf(s)로 침전하는 데 필요한 시간이다.

절차

미분원심분리기는 온전한 입자(예: 생물학적 세포, 미세입자, 나노입자)와 함께 사용하거나 주어진 입자의 성분 부분을 분리하는 데 사용할 수 있다.[7]온전한 세포로부터 진핵 유기체의 분리의 예를 이용하여, 먼저 세포는 리싱되고 균질화되어야 한다(이상적으로 도운스 균질화와 같은 부드러운 기법에 의해; 더 가혹한 기술이나 지나친 균질화는 온전한 유기체의 낮은 비율을 초래할 것이다).조악한 오르가넬 추출물을 얻은 후에는 다음과 같이 다양한 원심분리 속도를 적용하여 오르가넬을 분리할 수 있다.

생물 검체에[2] 대한 일반적인 차동 원심분리 매개변수(원심분리 경로 길이 ≈1–5 cm)
샘플입력 G 힘 시간 계측기 필요 펠릿 내용물 상등성 내용물
비독성(eukaryotic) 세포 100 x g 5분 벤치톱 고정각 원심분리기 또는 흔들리는 버킷 원심분리기 온전한 (유핵) 세포, 거시적 파편 샘플에 따라 다름
부드럽게 라이스 처리된 세포(예: 균질 생성기를 투하) 600 x g 10분 벤치톱 고정각 원심분리기 또는 흔들리는 버킷 원심분리기 핵 키토솔, 핵이 아닌 오르가넬류
이전 행의 상등성 15,000 x g 20분 벤치톱 고정각 원심분리기 미토콘드리아, 엽록체, 리소솜, 페록시솜 시토솔, 마이크로솜(포스트 미토콘드리아 슈퍼나트륨으로 알려져 있음)
이전 행의 상등성 50,000 x g - 100,000 x g 60분 고속 고정각 원심분리기 또는 진공초음파분쇄기 혈장막, 미세소분수, 대형 폴리보솜 시토솔, 리보솜 서브유닛, 작은 폴리보솜, 효소 복합체
이전 행의 상등성 50,000 x g - 100,000 x g 120분 진공초음파 리보솜 서브유닛, 작은 폴리 리보솜, 일부 수용성 효소 복합체 사이토솔

초밀도리퓨지션

라이스 샘플은 이제 초밀도리프 분쇄기에 원심분리할 준비가 되었다.초밀도리퓨지는 고속 회전이 가능한 전기 모터에 의해 구동되는 로터를 포함하는 냉장, 저압 챔버로 구성된다.샘플은 로터 내부 또는 로터에 부착된 튜브에 배치된다.회전 속도는 플로어 모델의 경우 최대 10만 rpm, 벤치탑 모델의 경우 최대 15만 rpm(벡만 옵티마 맥스-XP 또는 소르발 MTX150)에 이를 수 있으며, 80만 g에서 100만 g의 원심속력을 발생시킬 수 있다.이 힘은 고분자의 침전물을 유발하고 심지어 작은 분자의 균일하지 않은 분포를 유발할 수 있다.[8]null

세포의 다른 조각들은 크기와 밀도가 다르기 때문에, 각각의 조각들은 다른 최소 원심력을 가진 펠릿으로 정착할 것이다.따라서 시료를 서로 다른 층으로 분리하려면 먼저 원심분리기를 약한 힘으로 원심분리하여 펠릿을 제거한 다음 후속 상등물을 순차적으로 더 큰 원심장에 노출시킬 수 있다.매번 다른 밀도의 일부가 용기 바닥에 침전되어 추출되며, 반복적으로 적용하면 원래 샘플의 다른 부분을 포함하는 층이 생성된다.획득한 각 펠릿을 더욱 정교하게 다듬기 위해 추가 조치를 취할 수 있다.null

침전물은 고분자의 질량, 형태, 부분적인 특정 부피뿐만 아니라 용매 밀도, 로터 크기 및 회전 속도에 따라 달라진다.분자량을 계산하기 위해 실험하는 동안 침전 속도를 모니터링할 수 있다.침전 계수(S) 값을 계산할 수 있다.S(더 빠른 침전 속도)의 큰 값은 더 큰 분자량에 해당한다.고밀도 입자 퇴적물은 더 빠르게.길어진 단백질은 마찰 계수가 크고 침전물이 더 느리게 침전되어 정확성을 보장한다.[9]

차동 및 밀도 구배 원심분리 차이

미분 및 밀도 구배 원심분리 기법의 차이점은 후자의 방법이 샘플이 통과하는 서로 다른 밀도(예: 자당, 피콜) 또는 젤의 용액을 사용한다는 것이다.이것은 분자가 자기 것과 같은 밀도를 가진 매체에 도달할 때까지 원심력 아래 정착한다는 원리에 기초하여 상대 밀도에 의해 표본을 층으로 분리한다.[10]분리 정도나 층수는 용액이나 젤에 따라 달라진다.반면에, 차동 원심분리기는 밀도 구배를 이용하지 않고, 원심분리기는 증가속도로 취해진다.서로 다른 원심분리 속도는 종종 2개 이하의 분수로 분리를 생성하기 때문에 상등액은 추가 원심분리 단계에서 더 멀리 분리될 수 있다.이를 위해 원하는 입자가 분리될 때까지 각 단계마다 원심분리 속도를 높여야 한다.이와는 대조적으로 밀도 구배 원심분리기는 보통 원심분리속도를 1회만 가지고 실시된다.[11]null

참고 항목

라이브러리 리소스 정보
초밀도리퓨지션

참조

  1. ^ Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (19 April 2018). "Centrifugation and Ultracentrifugation". Wilson and Walker's Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273.
  2. ^ a b Darnell, James; Baltimore, David; Matsudaira, Paul; Zipursky, S. Lawrence; Berk, Arnold; Lodish, Harvey (2000). "Purification of Cells and Their Parts". {{cite journal}}:Cite 저널은 필요로 한다. journal=(도움말)
  3. ^ Griffith, Owen Mitch (2010). Practical Techniques for Centrifugal Separations – Application Guide (PDF). Principles & Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. p. 1-27.
  4. ^ Gerald Karp (19 October 2009). Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments. John Wiley & Sons. pp. 28–. ISBN 978-0-470-48337-4.
  5. ^ Livshits, Mikhail A.; Khomyakova, Elena; Evtushenko, Evgeniy G.; Lazarev, Vassili N.; Kulemin, Nikolay A.; Semina, Svetlana E.; Generozov, Edward V.; Govorun, Vadim M. (30 November 2015). "Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol". Scientific Reports. 5 (1): 17319. Bibcode:2015NatSR...517319L. doi:10.1038/srep17319. ISSN 2045-2322. PMC 4663484. PMID 26616523. S2CID 14200669.
  6. ^ Harding, Stephen E.; Scott, David; Rowe, Arther (16 December 2007). Analytical Ultracentrifugation: Techniques and Methods. Royal Society of Chemistry. ISBN 978-1-84755-261-7.
  7. ^ Frei, Mark. "Centrifugation Separations". BioFiles. 6 (5): 6–7.
  8. ^ Taylor, Douglas D.; Shah, Sahil (1 October 2015). "Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes". Methods. 87: 3–10. doi:10.1016/j.ymeth.2015.02.019. PMID 25766927.
  9. ^ Vance, Dennis E.; Vance, J. E. (6 August 1996). "Structure, assembly and secretion of lipoproteins". Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. Elsevier. ISBN 978-0-08-086092-3.
  10. ^ Sapkota, Anupama (3 September 2020). "Types of Centrifuge & Centrifugation (definition, principle, uses)". Microbe Notes.
  11. ^ Yu, Li-Li; Zhu, Jing; Liu, Jin-Xia; Jiang, Feng; Ni, Wen-Kai; Qu, Li-Shuai; Ni, Run-Zhou; Lu, Cui-Hua; Xiao, Ming-Bing (2018). "A Comparison of Traditional and Novel Methods for the Separation of Exosomes from Human Samples". BioMed Research International. 2018: 1–9. doi:10.1155/2018/3634563. PMC 6083592. PMID 30148165.