암시야 현미경법
Dark-field microscopy |
다크필드 현미경법(암흑지 현미경법이라고도 함)은 빛과 전자 현미경법 모두에서 현미경법을 설명하며, 이는 이미지에서 산란되지 않은 빔을 제외합니다.그 결과, 시료 주위의 장(즉, 빔을 산란시킬 시료가 없는 곳)은 대체로 어둡다.
광학 현미경에서는 대물 렌즈로부터 빛의 원뿔을 멀리 보내는 다크필드 콘덴서 렌즈를 사용해야 합니다.대물렌즈의 산란광 채집력을 최대화하기 위해 오일 침지법을 사용하며 대물렌즈의 개구수(NA)가 1.0 미만이어야 한다.NA가 높은 대물렌즈는 조절 가능한 횡격막이 있어 NA가 감소하는 경우에만 사용할 수 있습니다. 이러한 대물렌즈는 종종 0.7에서 1.25까지 [1]가변적인 NA를 가집니다.
광현미경 응용 프로그램
광학 현미경 검사에서 다크 필드(dark-field)는 비장 샘플의 대비를 향상시키는 데 사용되는 조명 기술을 나타냅니다.이는 대물 렌즈가 수집하지 않으므로 이미지의 일부를 형성하지 않는 빛으로 샘플을 비추는 방식으로 작동합니다.이것은 밝은 물체가 그려진 어둡고 거의 검은 배경의 고전적인 모습을 만들어냅니다.
빛의 경로
이 단계는 반전 현미경을 사용하는 그림에 나와 있습니다.
- 샘플의 조명을 위해 빛이 현미경으로 들어갑니다.
- 특수 크기의 디스크인 패치 스톱(그림 참조)은 광원으로부터의 빛을 차단하여 외부 조명 링을 남깁니다.광상환도 저배율로 합리적으로 치환할 수 있다.
- 콘덴서 렌즈는 빛을 샘플 쪽으로 집중시킵니다.
- 빛이 샘플에 들어갑니다.대부분은 직접 전송되고 일부는 샘플에서 산란됩니다.
- 산란된 빛은 대물 렌즈로 들어가지만 직접 투과된 빛은 단순히 렌즈를 놓치고 직접 조명 블록으로 인해 수집되지 않습니다(그림 참조).
- 직접 투과되는 빛은 생략한 채 산란광만이 화상을 생성한다.
장점과 단점
다크필드 현미경은 매우 간단하지만 효과적인 기술로 조직 배양물의 도말이나 개별 수인성 단세포 유기체의 도말과 같이 살아있는 생물 샘플과 유지되지 않은 생물 샘플을 사용하는 데 적합합니다.설정의 단순성을 고려하면, 이 기술로 얻을 수 있는 화질은 인상적입니다.
다크 필드 현미경의 한 가지 제한 사항은 최종 이미지에서 볼 수 있는 낮은 광도입니다.즉, 샘플이 매우 강하게 조명되어야 하므로 샘플이 손상될 수 있습니다.
다크필드 현미경 검사 기술은 거의 완전히 DIC 및 위상 대비 이미징의 전형적인 후광 또는 릴리프 스타일의 아티팩트가 없습니다.이는 위상 정보에 대한 민감도를 희생하는 것입니다.
밝은 영역 현미경 영상의 일반적인 어두운 특징은 보이지 않을 수 있으므로 어두운 영역 영상의 해석은 매우 신중하게 수행해야 합니다.일반적으로 어두운 영역 화상은 밝은 영역 화상과 관련된 낮은 공간 주파수를 결여하여 이미지를 기본 구조의 높은 통과 버전으로 만듭니다.
다크 필드 영상은 처음에는 밝은 필드 영상의 음으로 보일 수 있지만, 각각 다른 효과를 볼 수 있습니다.밝은 영역 현미경 검사에서는 입사광에 의해 표면에 그림자가 드리워지거나 표면의 일부가 반사율이 낮아지는 경우에 따라서는 피트 또는 긁힌 자국이 있을 수 있습니다.너무 매끄러워서 그림자를 드리울 수 없는 융기된 피쳐는 밝은 필드 이미지에 나타나지 않지만 피쳐의 측면에 반사되는 빛은 어두운 필드 이미지에 표시됩니다.
- 티슈 페이퍼 샘플에서 콘트라스트를 생성하는 데 사용되는 투과 조명 기술 비교(최대 분해능으로 볼 경우 1.559 μm/픽셀)
암시야 조명, 샘플 대비는 샘플이 산란시킨 빛에서 나옵니다.
컴퓨팅에 사용
최근 컴퓨터 마우스 포인팅 장치에 다크필드 현미경 검사가 적용되어 유리 표면의 미세한 흠집과 먼지를 촬영함으로써 마우스가 투명한 유리 위에서 작업할 수 있게 되었다.
초분광 이미징과 결합된 암시야 현미경 검사
초분광 이미징과 결합할 때, 다크 필드 현미경은 세포에 내장된 나노 물질의 특성화를 위한 강력한 도구가 됩니다.최근 출판물에서 팻스코프스키 외.CD44+ 암세포를 대상으로 [2]한 금 나노입자(AuNPs)의 부착을 연구하기 위해 이 기술을 사용했다.
투과 전자 현미경 응용 프로그램
투과전자현미경법에서의 다크필드 연구는 결정과 결함에 대한 연구뿐만 아니라 개별 원자의 이미징에도 강력한 역할을 한다.
종래의 다크 필드 이미징
간단히 말해서, 이미징은[3] 입사보다는 회절된 빔이 대물렌즈 백포커스 평면의 작은 대물 구멍을 통과할 때까지 입사 조명을 기울이는 것을 포함합니다.이러한 조건 하에서 다크필드 이미지는 단일 회절면 집합에서 나오는 회절 강도를 시료에 투영된 위치의 함수 및 시료 기울기의 함수로 매핑할 수 있다.
단결정 표본에서는 브래그 상태에서 바로 기울어진 표본의 단반사 암영상을 통해 주변의 격자 평면을 구부리는 전위 또는 침전물 같은 격자 결점만 "밝힐 수 있습니다".그런 다음 이러한 영상의 강도 분석을 사용하여 굽힘의 양을 추정할 수 있습니다.반면 다결정 표본에서 다크필드 이미지는 특정 방향에서 브래그가 반사하는 결정의 하위 집합만 밝히는 역할을 합니다.
| 애니메이션: 결정의 다크필드 이미징 |
|---|
| 이 애니메이션은 DC 피크(또는 산란되지 않은 빔)가 중앙 아래에 있는 상태에서 표시된 파워 스펙트럼(후방 초점 평면의 광회절 패턴의 디지털 대체물)에서 개구부(왼쪽 주황색 그림 중심)의 움직임을 보여 줍니다.조리개 안으로 회절하는 주기가 투영된 나노 결정만이 오른쪽의 어두운 필드 이미지에서 켜집니다.개구부는 금 2.3Ω(111) 격자 간격에서 회절과 관련된 링 주위로 1.25°씩 이동합니다. |
약한 빔 이미징
약빔 이미징은 기존의 다크필드와 유사한 광학장치를 포함하지만, 회절빔 자체보다는 회절빔 고조파를 사용합니다.이것에 의해, 결함 주위의 왜곡 영역의 훨씬 높은 분해능을 얻을 수 있다.
저각 및 고각 고리형 다크필드 이미징
고리형 다크필드 이미징은 비파손 빔을 중심으로 하지만 포함하지 않는 고리형 구멍에 전자가 회절된 이미지를 형성해야 합니다.주사 투과 전자 현미경에서 큰 산란 각도의 경우, 이것은 고원자 번호 원자의 강화된 산란 때문에 때때로 Z-대조 이미징이라고 불립니다.
디지털 다크필드 분석
이것은 전자현미경 격자-프링 이미지와 같이 명확한 주기성을 가진 이미지를 탐색하기 위한 직접 및 상호(Fourier-transform) 공간 사이의 수학적 기법입니다.투과 전자 현미경의 아날로그 암시장 이미징과 마찬가지로 관심 주기가 존재하는 시야에서 이러한 물체를 "밝힐" 수 있습니다.아날로그 다크필드 이미징과는 달리, 벡터 격자 스트레인에 대한 정량적 정보를 제공하는 주기성의 푸리에 위상, 즉 위상 구배를 매핑할 수도 있습니다.
「 」를 참조해 주세요.
각주
- ^ 니콘: 다크필드 일루미네이션
- ^ S. Patskovsky; et al. (2014). "Wide-field hyperspectral 3D imaging of functionalized gold nanoparticles targeting cancer cells by reflected light microscopy". Journal of Biophotonics. 8 (5): 1–7. doi:10.1002/jbio.201400025. PMID 24961507.
- ^ P. 허쉬, A.Howie, R.Nicholson, D. W. Pashley 및 M. J. Wheelan(1965/1977) 얇은 결정의 전자 현미경 검사(Butterworths/Krieger, London/Malabar FL) ISBN 0-88275-376-2.
외부 링크
| 라이브러리 리소스 정보 암시야 현미경법 |
- 니콘 - 입체 현미경 검사 > 다크필드 조명
- 분자 표현
- 다크필드 조명 프라이머
- 게이지 SH. 1920현대 암시장 현미경과 그 발전의 역사.미국 현미경학회 39(2) 거래: 95~141.
- 다크 필드 및 위상 대비 현미경(University Paris Sud)
| 조명 및 콘트라스트법 |  | |
|---|---|---|
| 형광법 | ||
| 서브회절 제한 기술 | ||
