온도 그라데이션 젤 전기영양증

Temperature gradient gel electrophoresis
에티듐브로마이드에 오염된 DGGE 젤의 부정적인 이미지

온도 그라데이션 젤 전기영동(TGE)과 변성 그라데이션 젤 전기영동(DGGE)은 온도 또는 화학적 그라데이션 중 하나를 사용하여 아크릴아미드 젤을 통과할 때 샘플을 변성하는 전기영동체의 일종이다.TGGE와 DGGE는 DNA와 RNA와 같은 핵산, 그리고 (비공통적으로) 단백질에 적용될 수 있다.TGGE는 핵산을 분리하기 위해 구조물의 온도 변화에 의존한다.DGGE는 기본 쌍 순서에 따라 결정되는 서로 다른 변성 능력을 바탕으로 동일한 크기의 유전자를 분리한다.DGGE는 독창적인 기술이었고, TGE는 그것을 정교하게 다듬었다.null

역사

DGGE는 SUNY Albany의 교수로 있을 때 Leonard Lerman에 의해 발명되었다.[1][2][3]null

토마스 E가 처음 한 단백질 분석에 같은 장비를 사용할 수 있다.영국 케임브리지 MRC 분자생물학 연구소의 크리톤.[4]비슷하게 생긴 패턴은 단백질과 핵산에 의해 만들어지지만 근본 원리는 사뭇 다르다.null

TGGE는 대처와 호드슨에 의해 그리고 조지아 공대의 로저 바텔에 의해 처음 설명되었다.독일에서 리즈너 그룹이 광범위한 작업을 했다.DGGE를 위한 상업용 장비는 Bio-Rad, UNENEY, CBS Scientific에서, TGGE용 시스템은 Biometra에서 사용할 수 있다.null

온도 그라데이션 젤 전기영양증

DNA는 음전하를 가지고 있어서 전기장의 양극 전극으로 이동할 것이다.겔은 분자 메쉬로, DNA 줄의 직경과 거의 같은 크기의 구멍을 가지고 있다.전기장을 적용하면 DNA는 DNA 분자의 길이에 반비례하는 속도로 젤을 통해 이동하기 시작할 것이다(DNA 이동 속도가 더 빠름). 이것이 표준 전기영양에서 크기 의존적 분리의 기초가 된다.null

TGGE에서는 또한 겔에 걸친 온도 구배가 있다.상온에서 DNA는 이중 가닥 형태로 안정적으로 존재할 것이다.온도가 올라가면 가닥들이 분리되기 시작하고(융해) 젤을 통해 이동하는 속도가 급격히 감소한다.비판적인 관점에서는, 녹아서 발생하는 온도는 시퀀스(GCbasepairs 더 AT보다 안정되기 때문에 쌓아 놓고 상호 작용 때문이 아닌에게 그 차이에서 수소 bonds[표창 필요한](이 세개의 수소 결합 사이의 cytosine과guanine 기지 한켤레만 둘 사이에는 아데닌과 티민)=, 그래서 TGGE가``sequenc을 제공한다 달려 있다.e,siz 의존e 독립적 방법" DNA 분자를 분리하기 위한 것.TGGE는 분자를 분리하고 용해 행동과 안정성에 대한 추가 정보를 제공한다(Biometra, 2000).null

변성 그라데이션 젤 전기영양증

변성 그라데이션 젤 전기영양증(DGGE)은 변성제가 함유된 전기영양증 겔에 DNA(또는 RNA)의 작은 샘플을 가하여 작용한다.연구원들은 특정 변성 겔이 다양한 단계에서 DNA가 녹도록 유도할 수 있다는 것을 발견했다.이렇게 녹은 결과, DNA는 겔을 통해 퍼지며, 200~700개의 염기쌍 정도의 작은 성분이라도 단일 성분에 대해 분석할 수 있다.null

DGGE 기법의 독특한 점은 DNA가 점점 극단적인 변성 조건에 노출되면서 녹은 가닥들이 완전히 한 가닥으로 조각난다는 점이다.변성 젤에 변성하는 과정은 매우 날카롭다: "지퍼처럼 연속적으로 부분적으로 녹는 것보다 대부분의 파편이 단계적 과정으로 녹는다.조각의 개별 부분 또는 영역이 변성 조건의 매우 좁은 범위 내에서 갑자기 단일 가닥이 된다."(Helms, 1990).이것은 다양한 유전자의 DNA 시퀀스나 돌연변이의 차이를 구별할 수 있게 해준다: 같은 길이의 조각들의 시퀀스 차이는 종종 구배에서 다른 위치에서 부분적으로 녹게 하고 따라서 젤의 다른 위치에서 "정지"하게 한다.변성 그라데이션 젤에서 다형 DNA 조각의 용해 동작을 나란히 비교함으로써 첫 번째 용해 영역에서 돌연변이가 있는 파편을 검출할 수 있다(Helms, 1990).겔 위에 두 개의 샘플을 나란히 놓고 함께 변성시킬 수 있게 하면, 연구자들은 두 개의 샘플이나 DNA 조각의 아주 작은 차이도 쉽게 볼 수 있다.

이 기법에는 여러 가지 단점이 있다: "DGGE에서 사용되는 화학적 그라데이션과 같은 화학적 그라데이션은 재현성이 떨어지고, 확립이 어려우며, 이질적 복합체를 완전히 해결하지 못하는 경우가 많다." (Westburg, 2001)이러한 문제들은 TGE에 의해 다루어진다. TGE는 화학적 경사가 아닌 온도를 사용하여 샘플을 변성시킨다.null

방법

TGE에 의해 핵산을 분리하기 위해서는 다음 단계를 수행해야 한다: 젤, 전기영동, 얼룩, DNA 용출.완충 시스템을 선택해야 하기 때문에 온도가 상승하는 상황에서 시스템이 안정적으로 유지되는 것이 중요하다.따라서, 요소들은 일반적으로 젤 제제에 이용된다. 그러나, 연구자들은 사용된 요소들의 양이 DNA를 분리하는데 필요한 전체 온도에 영향을 미친다는 것을 알아야 한다.[6]젤을 장착하고, 샘플은 실행 중인 젤의 유형(예: 평행 또는 수직)에 따라 젤 위에 배치되며, 전압이 조정되고 샘플이 실행되도록 놔둘 수 있다.[6]수직이든 평행이든 어떤 유형의 TGGE를 실행할 것인가에 따라 다양한 양의 샘플을 준비하고 로드해야 한다.많은 양의 샘플이 수직으로 사용되며, 적은 양의 샘플이 병렬 TGE와 함께 사용된다. 젤을 실행한 후에는 젤을 염색하여 결과를 시각화해야 한다.이런 용도로 사용할 수 있는 얼룩이 여러 개 있지만, 은빛 얼룩이 가장 효과적인 도구임이 입증되었다.[6]이 DNA는 은색 얼룩에서 용출되어 PCR 증폭을 통해 추가 분석을 할 수 있다.[6]null

적용들

TGGE와 DGGE는 생물 의학 및 생태학 연구에 광범위하게 유용하다. 선택된 용도는 아래에 설명되어 있다.null

mtDNA의 돌연변이

웡, 량, 권, 바이, 알퍼, 그로프만의 최근 조사에 따르면,[7] TGE를 개인의 미토콘드리아 DNA를 검사하는데 활용할 수 있다.이들 저자들에 따르면 TGGE는 미토콘드리아 게놈의 두 가지 새로운 돌연변이를 판별하는데 활용되었는데, "미토콘드리아 세포독성(mtDNA) 공통의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 포인트 돌연변이와 삭제에 대해서는 음성인 21세 여성이 온도 gr에 의한 미토콘드리아 게놈 전체의 알려지지 않은 돌연변이를 검사했다."Edient gel electrophoresis".[8]null

p53 췌장 분비물 돌연변이

로어와 동료들(2001)은 췌장암이 없는 개인의 췌장 분비물에 대한 포괄적인 연구에서 p53 돌연변이가 소수의 참가자의 췌장액에서 발견될 수 있다고 보고한다[citation needed].p53의 돌연변이가 췌장암에서 광범위하게 발견되었기 때문에, 이번 연구를 위한 연구원들은 그 돌연변이 자체가 췌장암의 발달과 연관될 수 있는지를 알아내기 위해 노력하고 있었다.Lohr는 몇몇 과목에서 TGGE를 통해 p53 돌연변이를 발견할 수 있었지만, 그 후에 췌장암이 발병한 것은 없었다.따라서 연구진은 p53 돌연변이가 췌장암 종양 발생의 유일한 지표가 아닐 수 있다는 점에 주목하며 결론을 내린다.null

미생물생태학

작은 리보솜 서브유닛 코딩 유전자의 DGGE는 레이든 대학교에서 포스트닥으로 재직하던 [9]중 제라드 머이저에 의해 처음 설명되었으며, 미생물 생태학에서 널리 사용되는 기법이 되었다.null

혼합 미생물군에서 추출한 DNA를 16S rRNA의 박테리아와 고대의 유전자 파편 전용 PCR 프라이머와 18S rRNA의 eukaryotes의 유전자 파편과 함께 PCR 제품의 혼합을 초래한다.이 앰프들은 모두 길이가 같기 때문에 아가로스겔 전기영동증에 의해 서로 분리될 수 없다.그러나 서로 다른 미생물 rRNA 사이의 시퀀스 변화(즉, GC 함량 및 분포의 차이)는 이러한 DNA 분자의 변성 특성을 다르게 만든다.null

따라서 DGGE 밴딩 패턴은 미생물 유전적 다양성의 변화를 시각화하고 우세한 미생물 공동체 구성원의 풍부함을 대략적으로 추정할 수 있다.이 방법을 흔히 커뮤니티 지문 채취라고 한다.최근 여러 연구에서 기능유전자(예: 황 감소, 질소 고정, 암모늄 산화에 관련된 유전자)의 DGGE가 미생물 기능과 혈전화에 대한 정보를 동시에 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다.예를 들어, 타바타바이 외 연구진.(2009) 팜유밀 방류제(POME)의 혐기성 발효 시 DGGE를 적용하여 미생물 패턴을 최초로 밝혀냈다.[10]null

참조

  1. ^ 1979년 1월 16일 (1:191-200)2차원 젤 전기영양에서 DNA 제한 조각의 길이 독립적인 분리.피셔 SG, Lerman LS
  2. ^ Fischer S. G.와 Lerman L. S. "순서의 특성에 따른 DNA의 무작위 파편 분리" Proc.나틀. 아카드.미국 과학, 1980년 77년 4420-424
  3. ^ Fischer S. G.와 Lerman L. S. "단일 베이스-페어 대체에 의해 다른 DNA 조각들은 변성 그라데이션 젤: 용해 이론과의 일치" Proc에서 분리된다.나틀. 아카드.Sci. USA, 1983, 80, 1579-1583.
  4. ^ J Mol Biol.1994년 10월 7일:242(5):670-82.황색 포도상구균 누클리스의 변성 상태의 전기적 특성.크리톤 TE, 쇼틀 D.
  5. ^ 생체 화학.J. (1981) 197, 105-109
  6. ^ a b c d (Biometra, 2000).[citation needed]
  7. ^ L#J C Wong, D Yim, R#K Bai, H Kwon, H Kwon, M M Vacek, Jane, C L Hoppel e D Cer.미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 복합 I 결핍증과 연관된 미토콘드리아 tRNASer(AGY) 유전자의 새로운 돌연변이.J메드제네트.Stembro de 2006; 43(9): e46. doi: 10.1136/jmg. 2005.040626.PMCID: PMC2564579.PMID 16950817.
  8. ^ (원 외, 2002).[citation needed]
  9. ^ Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993) 16S rRNA에 대한 중합효소 체인 반응 증폭 유전자 코딩의 그라데이션 젤 전기영양 분석을 통한 복잡한 미생물 개체군의 프로파일링. Apply Environment Microbiol. 59:695-700.
  10. ^ PCR 기반 DGGE 및 PHI 분석 팜 오일밀 방류제를 처리하는 혐기성 폐쇄 디지스터 탱크 내 메탄노균 분석메이삼 타바타바이이, 모하 라페인 자카리아, 라하 압둘 라힘, 안드레-데니스 G.라이트, 시라이 요시히토, 압둘라 노라니, 사카이 겐지, 이케노 신야, 모리 마사쓰구, 나카무라 카즈노리, 알라위 술라이만, 모히드 알리 하산, 2009년 7월 15일자, 생명공학 전자저널 제12권 제3호, 2009년 7월 15일자, ISSN0717-3458
  • 찰스 J. 새일리, M.D. M.S. Parts는 2003년 "TGGE"라는 제목의 요약 논문에서 인용했다.필라델피아에 있는 과학 대학.