다르핀

DARPin

DARPins(안키린 반복 단백질을 설계하기 위한 약어)는 유전공학적으로 설계된 항체 모방 단백질로, 일반적으로 매우 구체적이고 높은 수준의 표적 단백질 결합을 나타낸다.그것들은 세포 신호, 조절, 구조적인 무결성 등 다양한 기능을 담당하는 자연 결합 단백질 중 하나인 자연적인 앤키린 반복 단백질에서 파생된다.DARPins는 최소 3개의 반복 모티브 또는 모듈로 구성되며, 이 중 가장 많은 N- 및 C-단자 모듈을 "캡"이라고 하는데, 이는 단백질의 소수성 코어를 차폐하기 때문이다.내부 모듈의 수는 숫자로 표시되며(예: N1C, N2C, N3C, ...), 캡은 각각 "N" 또는 "C"로 표시된다.4개(N2C) 또는 5개(N3C) 반복 DARPins에 대한 14 또는 18 kDa(킬로달톤)의 분자 질량은 생물학적(IgG 크기의 10%에 해당)에 비해 작다.

DARPins는 새로운 종류의 강력하고 구체적이며 다용도적인 소단백질 치료법을 구성하며, 다양한 연구, 진단 및 치료 응용 분야에서 조사 도구로 사용된다.[1]임상 및 임상 전 개발에서 여러 DARPin 분자를 보유한 임상 단계 바이오의약품 회사인 Molecular Partners AG는 현재 치료용 DARPins(전방 통합)의 자체 개발을 추진하고 있다.Athetbio AG는 파트너링 모델 접근방식을 위한 DARPin 비계를 더욱 개선하는데 기초한다.[2]

또한 DARPins는 G단백질결합수용체(GPCR)를 포함한 수용성 단백질과 막단 단백질의 결정체로서 결합 파트너 또는 표적 단백질에 대한 강체 결합으로 사용될 수 있다.[3][4][5]

기원, 구조 및 생성

앙키린 반복 모티브가 5개인 DARPin(PDB: 2QYJ)

DARPin 플랫폼은 스위스 취리히 대학의 안드레아스 플뤼크툰 연구실에서 재조합항체의 공학 및 도서관을 연구하던 중 발견되어 개발되었다.[6]DARPins는 자연에서 고선량 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 단백질 등급인 자연적으로 발생하는 앤키린 단백질에서 유래한다.

DARPin 라이브러리는 구조 기반 설계 및 재조합 DNA 방법과 결합된 수천 개의 자연 앤키린 반복 모티브(각각 약 33개의 아미노산)의 시퀀스 정렬을 통해 설계되었다.[6]이 단백질들은 큰 잠재적 표적 상호작용 표면을 가진 안정적인 단백질 영역을 형성하는 반복적인 구조 단위로 구성된다.일반적으로 DARPins는 4회 또는 5회 반복으로 구성되며, 이 중 첫 번째(N-caping repeat)와 마지막(C-caping repeat)은 수용성 단백질 노심을 수용성 환경으로부터 보호하는 역할을 한다.DARPins는 천연 앤키린 반복 단백질 영역의 평균 크기에 해당한다.반복이 3회 미만인 단백질(즉, 캡팅 반복과 내부 반복 1회)은 충분히 안정된 3차 구조를 형성하지 못한다.[7]DARPin의 분자 질량은 다음 도표와 같이 총 반복측정 횟수에 따라 달라진다.

반복 3 4 5 6 7 ...
대략적인 질량(kDa) 10 14 18 22 26 ...

10개 이상의12 변종 다양성을 가진 무작위 대상 상호작용 잔류물을 가진 DARPins의 라이브러리는 DNA 수준에서 생성되었다.이들 도서관에서 생화학자는 DARPins를 선택하여 피코폴라 친화력으로 선택 대상을 바인딩할 수 있으며, 특이성은 동종 분비가 가능한 신호 시퀀스를 이용한 리보솜 표시나[8] 페이지 표시를[9] 사용하여 선택할 수 있다.[10]DARPins는 수용체 작용제, 길항제, 역작용제, 효소 억제제 또는 단순 표적 단백질 바인더로 작용하도록 설계할 수 있다.[1]

DARPins의 속성 및 잠재적 이점

DARPins는 높은 수준의 대장균(발효 10g/l 이상, 쉐이크플라스크 1g/l 이상)의 세포질에서 수용성 형태로 표현된다.[11]단백질은 높은 열 및 열역학적 안정성(변성 중간점: 보통 평형 전개: usuallyG > 9.5 kcal/mol)이 반복 횟수가 증가함에 따라 증가한다.[6][12][13]DARPins는 인간 혈청이 안정적이며 T세포 에피포프를 포함하지 않도록 설계할 수 있다.

DARPins는 유연한 아키텍처뿐만 아니라 높은 특수성, 안정성, 효력 및 친화력 때문에 견고한 차체 바인딩 모드를 가지고 있다.[1][8]유전자 융합에 의해 만들어진 다중특정 또는 다중값 구조는 퓨전된 DARPins가 단일 도메인 DARPins와 유사한 결합 특성을 가지고 있음을 시사한다.[1]비계에 시스테인이 없는 것은 현장 고유 시스테인의 엔지니어링을 가능하게 하여 화학물질을 분자와 현장 주도의 결합을 가능하게 한다.비천연 아미노산은 같은 목적으로 도입될 수 있다.[14]

잠재적으로, DARPins는 일반적으로 단일 질병 경로를 목표로 하는 기존의 치료 접근방식의 한계를 극복함으로써 임상적 이익을 제공할 수 있으며 따라서 효율성이 저하될 수 있다.많은 경우에, 질병의 복잡성은 다중 경로의 잘못된 규제에서 기인한다.DARPIN 기술을 활용하여 바인딩 도메인(즉, 링커에 의해)이 연결되는 수천 개의 서로 다른 "멀티 DARPins"를 신속하게 생성함으로써 여러 질병 경로를 대상으로 할 수 있다.또한 DARPins와 multi-DARPins는 [15]독소와 같은 비 DARPin 요소에 융합되어 표적 치료제를 생성할 수 있으며, 그 제조는 DARPins의 집계에 대한 저항으로 촉진된다.다중 DARPins의 형식 다양성과 강건성은 특정 질병 경로에서 잠재적 활성을 가진 DARPins를 효율적으로 식별하기 위한 경험적 접근법(예: 결과 기반 선별을 통한)을 촉진한다.

DARPins의 잠재적인 이점은 구조 및 생물물리학적 특성에 크게 기인한다.그들의 작은 크기(14-18 kDa)는 조직의 침투율을 증가시킬 수 있다고 생각되며, 높은 효력(<5-100 pM)은 낮은 농도에서 DARPins를 활성화시킨다.[16]DARPins는 100 g/L 이하는 용해성이며, 높은 안정성과 용해성은 약물 화합물에 바람직한 성질로 간주된다.DARPins는 신속하고 비용 효율적으로 생산될 수 있다(즉, 대장균으로부터).그들의 약동학(PK) 특성은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 반감기 확장 분자에 대한 융접이나 인간 혈청 알부민에 대한 DARPins 결합에 의해 조절될 수 있다.생물물리학적 특성이 유리하기 때문에 DARPins는 표준 프로세스를 사용하여 개발 가능성이 높은 것으로 간주되며, 잠재적으로 강력한 계급 행동을 보인다.[1]

임상 개발 및 응용

DARPins는 연구 도구,[1] 진단제[16] 및 치료제로서 사용되어 왔다.[17][18][19][20]이 병원의 첫 DARPin 후보인 MP0112는 혈관 내피성장인자(VEGF) 억제제로 2010년 초 습윤기 관련 황반변성(Wet AMD, 일명 신근기 관련 황반변성)[15]과 당뇨병 황반부종[21] 치료를 위한 임상시험에 들어갔다.

현재 MP0112는 세 가지 임상시험에서 조사되고 있다.처음 두 실험은 일본인과 비일본인 환자 간의 비교가능성을 확립하기 위한 습식 AMD 환자에 대한 지방자치단체의 안전성과 효능 연구다.[17][19]세 번째 연구는 DME 환자에 대한 자치체의 안전성과 효능을 시험하는 것이다.[18]

2014년 7월 Molecular Partners는 두 번째 DARPin 후보인 MP0250의 암 환자의 안전성, 허용성 및 혈액 수준을 조사하기 위해 인간 내 첫 번째 연구를 시작했다.[20]

Molecular Partners AG는 안과, 종양학, 면역종양학, 면역학을 포함한 다양한 질병 영역에서 잠재적인 징후와 함께 임상 전 발달에 있어 여러 DARPins를 추가로 보유하고 있다.

참조

  1. ^ a b c d e f Plückthun A (2015). "Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy". Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 55 (1): 489–511. doi:10.1146/annurev-pharmtox-010611-134654. PMID 25562645.
  2. ^ www.athebio.com
  3. ^ Mittl PR, Ernst P, Plückthun A (February 2020). "Chaperone-assisted structure elucidation with DARPins". Current Opinion in Structural Biology. 60: 93–100. doi:10.1016/j.sbi.2019.12.009. PMID 31918361.
  4. ^ Deluigi M, Klipp A, Klenk C, Merklinger L, Eberle SA, Morstein L, Heine P, Mittl PR, Ernst P, Kamenecka TM, He Y, Vacca S, Egloff P, Honegger A, Plückthun A (January 2021). "Complexes of the neurotensin receptor 1 with small-molecule ligands reveal structural determinants of full, partial, and inverse agonism". Science Advances. 7 (5): eabe5504. doi:10.1126/sciadv.abe5504. PMC 7840143. PMID 33571132.
  5. ^ Deluigi M, Morstein L, Schuster M, Klenk C, Merklinger L, Cridge RR, de Zhang LA, Klipp A, Vacca S, Vaid TM, Mittl PR, Egloff P, Eberle SA, Zerbe O, Chalmers DK, Scott DJ, Plückthun A (January 2022). "Crystal structure of the α1B-adrenergic receptor reveals molecular determinants of selective ligand recognition". Nature Communications. 13 (1): 382. doi:10.1038/s41467-021-27911-3. PMID 35046410.
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  10. ^ Steiner D, Forrer P, Stumpp MT, Plückthun A (May 2006). "Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display". Nature Biotechnology. 24 (7): 823–831. doi:10.1038/nbt1218. PMID 16823375. S2CID 869587.
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  12. ^ Kohl A, Binz HK, Forrer P, Stumpp MT, Plückthun A, Grütter MG (May 2003). "Designed to be stable: Crystal structure of a consensus ankyrin repeat protein". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (4): 1700–1775. Bibcode:2003PNAS..100.1700K. doi:10.1073/pnas.0337680100. PMC 149896. PMID 12566564.
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