전사 활성제 유사 이펙터 누클레스

Transcription activator-like effector nuclease
조광 TAL-FokI 융합의 공간 채우기 도면(파란색: TALE; 녹색: FokI) David Goodsell에 의해 DNA에 바인딩(PDB: 1FOK, 3UGM)
다음에 대한 시리즈 일부
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유전자변형생물
역사와 규정
과정
적용들
논란

전사 활성제 유사 이펙터 핵(TALEN)은 DNA의 특정 시퀀스를 절단하도록 설계할 수 있는 제한 효소다. 그것들은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 분할 영역(DNA 가닥을 자르는 누클리스)에 융합하여 만들어진다. 전사 활성제(TAL)는 실질적으로 원하는 DNA 서열과 결합하도록 설계될 수 있으므로 누클리스와 결합할 경우 특정 위치에서 DNA를 절단할 수 있다.[1] 제한 효소는 유전자 편집이나 현장에서 유전체 편집에 사용하기 위해 세포에 도입될 수 있는데, 이 기술은 공학적 핵들을 이용한 게놈 편집이라고 알려져 있다. 아연 핑거 핵, 크리스퍼/Cas9와 함께 TALEN은 게놈 편집 분야에서 두드러진 도구다.

TALE DNA 결합 도메인

TAL 임팩터는 식물을 감염시킬 때 크산토모나스균이 타입 III 분비 시스템을 통해 분비하는 단백질이다.[2] DNA 결합 영역은 12번째 아미노산과 13번째 아미노산이 서로 다른 33–34 아미노산 염기서열을 반복적으로 보존하고 있다. Repeat Variable Diresidue(RVD)로 불리는 이 두 위치는 가변성이 매우 높으며 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다.[3][4] 아미노산 염기서열과 DNA 인식 사이의 이러한 직접적인 관계는 적절한 RVD를 포함하는 반복 세그먼트의 조합을 선택함으로써 특정 DNA 결합 영역의 엔지니어링을 가능하게 했다.[1] 특히, RVD의 약간의 변경과 "비관습적" RVD 시퀀스의 통합은 타겟팅 특수성을 개선할 수 있다.[5]

디엔에이 갈라짐

FokI endonuclease의 끝에서 나온 비특정 DNA 갈라짐 도메인은 효모 측정에서 활성인 혼합핵을 만드는 데 사용될 수 있다.[6][7] 이 시약들은 식물 세포와[8][9] 동물 세포에서도 활동한다.[9][10][11][12] 초기 TALEN 연구에서는 와일드 타입 FokI cleavage 도메인을 사용했지만, 후속 TALEN 연구에서는[11][13][14] 또한 FokI cleavage 도메인 변형을 사용했으며, 갈라짐 특이성과[15][16] 갈라짐 활동을 개선하기 위해 고안된 돌연변이를 사용했다.[17] FokI 도메인은 조광기 역할을 하므로 적절한 방향과 간격을 가진 대상 게놈의 사이트에 대해 고유한 DNA 결합 도메인을 가진 두 개의 구조가 필요하다. TALE DNA 결합 영역과 FokI 분할 영역 사이의 아미노산 잔류물의 수와 두 개별 TALEN 결합 사이트 사이의 염기 수는 모두 높은 수준의 활동을 달성하는 데 중요한 매개변수로 보인다.[10][18]

엔지니어링 TALEN 구성 요소

TAL 결합 영역의 아미노산 염기서열과 DNA 인식 사이의 단순한 관계는 단백질의 효율적인 엔지니어링을 가능하게 한다. 이 경우, 인공 유전자 합성은 TAL 바인딩 영역에서 발견되는 반복 시퀀스의 부적절한 분리로 인해 문제가 된다.[19] 이에 대한 한 가지 해결책은 공개 가능한 소프트웨어 프로그램(DNAWorks)[20]을 사용하여 전체 유전자 증폭에 따른 2단계 PCR 올리고뉴클레오티드 조립체에서 조립에 적합한 올리고뉴클레오티드를 계산하는 것이다. 엔지니어링된 TALE 구조를 생성하기 위한 다수의 모듈형 조립 방식도 보고되었다.[9][19][21][22][23][24] 두 방법 모두 아연 핑거 DNA 인식 영역을 생성하기 위한 모듈식 조립 방법과 개념적으로 유사한 엔지니어링 DNA 결합 영역에 대한 체계적인 접근방식을 제공한다.

TALEN을 사용한 YFG(YFG)의 게놈 편집 워크플로우. 대상 시퀀스를 식별하고 해당 TALEN 시퀀스를 설계하여 플라스미드에 삽입한다. 플라스미드는 대상 세포에 삽입되어 기능적인 TALEN을 생성하는데, 그 세포는 핵으로 들어가 대상의 순서를 묶고 갈라놓는다. 용도에 따라 오류(대상 유전자를 박살내는 것)를 도입하거나 대상 유전자에 새로운 DNA 서열을 도입하는 데 사용할 수 있다.

전염

일단 TALEN 구조가 조립되면, 그것들은 플라스미드에 삽입된다; 그리고 나서 대상 세포들은 플라스미드로 전염되고, 유전자 생산물들은 표현되고 게놈에 접근하기 위해 핵으로 들어간다. 대신, TALEN 구조물은 mRNA로 세포에 전달될 수 있으며, 이는 TALEN-expressing 단백질의 게놈적 통합 가능성을 제거한다. 또한 mRNA 벡터를 사용하면 유전자 편집 중 호몰로지 지시 수리(HDR)의 수준과 내성 성공률을 획기적으로 높일 수 있다.

게놈 편집

메커니즘

TALEN은 세포가 수리 메커니즘으로 반응하는 DSB(이중 스트랜드 브레이크)를 유도해 게놈 편집에 활용할 수 있다.

비호몰로겐 엔드 결합(NHEJ)은 쌍곡선 파단 양쪽에서 DNA를 직접 연결하며, 이 때 수열이 거의 또는 전혀 겹치지 않는다. 이 수리 메커니즘은 인델(삽입 또는 삭제) 또는 염색체 재배열을 통해 게놈의 오류를 유발한다. 이러한 오류는 해당 위치에서 유전자 생성물을 코드화하지 않게 만들 수 있다.[10] 이 활동은 사용되는 종, 세포형, 표적유전자, 누클리스 등에 따라 달라질 수 있으므로 새로운 시스템을 설계할 때 감시해야 한다. PCR에 의해 증폭된 두 개의 알레르기의 차이를 감지하는 간단한 이형중합체 분할 검사를 실행할 수 있다. 클라베지 제품은 간단한 아가로즈 젤이나 슬래브 젤 시스템에 시각화할 수 있다.

또는, DNA는 외생성 이중 가닥 DNA 조각이 있는 상태에서 NHEJ를 통해 게놈으로 유입될 수 있다.[10]

균질학 지시 수리는 또한 DSB에서 이물질 DNA를 도입할 수 있다. DSB는 감염된 이중 가닥 시퀀스가 수리 효소의 템플릿으로 사용되기 때문이다.[10]

적용들

TALEN은 식물 게놈을 효율적으로 변형시키는 데 사용되어,[25] 좋은 영양 품질을 가진 경제적으로 중요한 식량 작물을 만들어냈다.[26] 그들은 또한 생물연료 생산을 위한 도구를 개발하는데 이용되어 왔다.[27] 또한 안정적으로 변형된 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포(IPSCs) 복제와 인간 적혈구 세포라인을 설계해 [11][28]녹아웃 C.선충,[12] 녹아웃 쥐,[13] 녹아웃 쥐,[29] 녹아웃 제브라피쉬를 생성하는데 이용됐다.[14][30] 게다가, 이 방법은 노킨 유기체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 우 외는 탈렌 니카제를 사용하여 결핵의 저항력을 증가시키기 위해 Sp110 노킹 소에 접근했다.[31] 이 접근방식은 또한 TALEN mRNA 미세주사로 한 세포 배아에서 노킹 랫드를 생성하는 데 사용되었다.[32]

TALEN은 또한 질병을 일으키는 유전적 오류를 바로잡기 위해 실험적으로 이용되었다.[33] 예를 들어 겸상세포질환,[28][34] 자궁내막색소증,[35] 표피분해불소사 등 질환을 일으키는 유전적 결함을 교정하기 위해 체외에서 사용해 왔다.[36] 최근, TALEN은 면역 체계를 이용하여 암을 퇴치하는 도구로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다; TALEN 매개 타겟팅은 화학 요법 약물에 내성이 있는 T 세포를 생성하고 항-투석 활동을 보일 수 있다.[37][38]

이론적으로, 조작된 TALEN 퓨즈의 게놈 범위 특이성은 정확한 외생성 템플릿에서 동질학적으로 지시된 수리를 통해 개별 유전자 위치의 오류를 수정할 수 있다.[33] 그러나 현실적으로 TALEN의 현장 적용은 현재 효율적인 전달 메커니즘의 부재, 알려지지 않은 면역 유발 요인, TALEN 결합의 특수성 불확실성 등으로 제한되어 있다.[33]

TALEN의 또 다른 새로운 적용은 메가뉴클레아제 같은 다른 게놈공학 도구와 결합하는 능력이다. TAL 이펙터의 DNA 결합 영역은 메가누클리스의 갈라진 영역과 결합하여 사이트 주파수와 메가누클리스의 특수성이 낮은 TAL 이펙터의 공학적 용이성과 매우 구체적인 DNA 결합 활동을 결합한 하이브리드 아키텍처를 만들 수 있다.[39]

다른 게놈 편집 기술에 비해 TALEN은 난이도나 비용 면에서 중간이다. ZFN과 달리 TALEN은 단일 뉴클레오티드를 인식한다. ZNF와 그들의 표적 뉴클레오티드 세 쌍둥이와 상호작용을 만드는 것보다 TALEN DNA 결합 영역과 그들의 표적 뉴클레오티드 사이의 상호작용을 설계하는 것이 훨씬 더 간단하다.[40] 반면 크리스퍼는 단백질/DNA인식 대신 리보뉴클레오티드 복합형성에 의존한다.gRNA는 목표순서에 PAM 사이트가 부족해 실현가능성과 관련한 제약이 가끔 있으며, 저렴하게 생산할 수 있음에도 불구하고 현재의 개발은 TALEN의 비용절감을 현저히 초래하여 I가 되고 있다.CRISPR 기반 게놈 편집과 비슷한 가격과 시간 범위.

TAL 이펙터 누클레스 정밀도

활성 누실제의 목표 외 활동으로 인해 원치 않는 이중 가닥이 끊어질 수 있으며 결과적으로 염색체 재배열 및/또는 세포 사망을 초래할 수 있다. 이용 가능한 기술의 상대적 누클레스 관련 독성을 비교하기 위한 연구가 수행되었다. 이러한 연구와 DNA 결합과 누클레스 활동 사이의 최대 이론적 거리를 바탕으로, TALEN 구조물은 현재 이용 가능한 기술 중에서 가장 높은 정밀도를 가지고 있는 것으로 생각된다.[41]

참고 항목

참조

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외부 링크

  • E-TALEN.org TALEN 설계를 위한 포괄적인 도구
  • PDB 분자 이달의 분자 단백질 데이터베이스의 월간 구조 하이라이트