인겔 소화

In-gel digestion

겔 내 소화 단계는 단백질 분석 과정에서 단백질의 질량 분광학적 식별을 위한 샘플 준비의 일부이다.이 방법은 로젠펠트에 [1]의해 1992년에 도입되었다.절차의 기본 요소에는 무수한 수정과 개선이 [2][3][4][5][6][7]남아 있습니다.

겔 내 소화 단계는 주로 단백질 내 시스테인의 파괴, 환원 및 알킬화(R&A), 단백질의 단백질 분해 분해 및 생성된 펩타이드의 추출의 4단계로 구성된다.

소실

1D 또는 2D PAGE로 분리된 단백질은 보통 Coomassie Brilliant Blue(CBB) 또는 은과 같은 염료로 염색함으로써 시각화된다.이 방법의 민감도는 상당히 낮지만 은색 염색이 분석을 손상시키기 때문에 질량 분석 대상 샘플에 Coomassie를 사용하는 것이 더 일반적이다.겔에서 관심 있는 단백질 밴드를 제거한 후 대부분의 프로토콜은 진행하기 전에 단백질을 파괴해야 합니다.

CBB의 파괴용액에는 보통 완충염 중탄산암모늄(NHHCO43)과 30%~50%의 유기용매(대부분 아세토니트릴)가 포함되어 있습니다.단백질과 CBB 사이의 소수성 상호작용은 [8]용액의 유기 분율에 의해 감소한다.동시에 용액의 이온 부분은 염료와 단백질의 양전하 아미노산 사이의 정전 결합을 감소시킨다.물과 유기용매의 혼합에 비해 파괴효율이 높아진다.온도가 상승하면 파괴 [9]과정이 촉진됩니다.어느 정도(<10%)까지 파괴 절차는 [10]단백질 손실을 동반한다.또한 CBB의 제거는 질량분석 [7][11]측정에서 펩타이드 수율에 영향을 주지 않는다.

은염색단백질밴드의 경우 단백질에 부착된 금속은을 펠리시안화칼륨 또는 과산화수소(HO22)[12][13]에 의해 산화함으로써 파괴한다.방출된 은 이온은 티오황산나트륨에 의해 그 후에 복합화된다.

저감 및 알킬화(R&A)

겔의 염색과 소실은 종종 단백질의 시스틴 또는 시스테인의 감소와 알킬화(r&a)에 뒤따른다.이것에 의해, 단백질의 디술피드 결합을 불가역적으로 분해해, 3차 구조의 최적 전개를 얻을 수 있다.티올에 대한 환원은 술피드릴 또는 디티오트레이톨(DTT) 또는 트리스-2-카르복시에틸포스핀 염산염(TCEP)과 같은 포스핀 그룹을 포함하는 화학 물질과의 반응에 의해 달성됩니다.이후 요오드아세트아미드에 의한 SH기의 비가역적 알킬화 과정에서 시스테인은 안정된 S-카르복시아미도메틸시스테인(CAM; 부가물: -CH-CONH22)으로 변환된다.따라서 시스테인 아미노산 잔기의 분자량을 103.01Da에서 160.03Da로 증가시킨다.

시스테인 잔기의 환원 및 알킬화는 펩타이드 수율 및 배열 커버리지 및 다량의 디술피드 [14][15]결합을 가진 단백질의 동정성을 향상시킨다.대부분의 단백질에 대한 아미노산 시스테인의 희귀성으로 인해 r&a 단계는 질량분석의 [5][10][16][17]개선에 영향을 미치지 않는다.시스테인의 정량적 및 균질적 알킬화에 있어서 시료 준비 공정에서의 수정 단계의 위치는 매우 중요하다.겔에는 시스테인 잔기를 [18][19][20][21]비가역적으로 수정할 수 있는 유리 아크릴아미드 모노머가 존재하므로 전기영동을 수행하기 전에 전기영동을 변성시키는 것이 강력히 권장된다.생성된 아크릴아미드 부가물은 분자량이 174.05Da이다.

인겔 소화

그 후, 본방법의 동명 공정을 실시해, 단백질의 겔내 소화를 실시한다.이것에 의해, 단백질은 효소적으로 단편을 한정된 개수로 절단된다.이 조각들은 펩타이드라고 불리며 단백질의 특징적인 질량과 패턴으로 식별을 가능하게 한다.세린 프로테아제 트립신은 단백질 분석에 사용되는 가장 일반적인 효소이다.트립신은 염기성 아미노산 아르기닌과 리신의 카르복실 말단에서 펩타이드 결합을 특이적으로 절단한다.절단부위 바로 근처에 아스파라긴산이나 글루탐산 등의 산성 아미노산이 있으면 가수분해 속도가 저하되어 절단부위 프롤린 C 말단이 가수분해를 [22]완전히 억제한다.

단백질 분해 효소의 사용으로 바람직하지 않은 부작용은 단백질 분해효소의 자가 소화이다.이를 피하기 위해 과거에는 Ca-ions를2+ 소화 [23][24]완충제에 첨가했다.오늘날 대부분의 공급업체는 리신의 선택적 메틸화가 아르기닌 절단 [25]부위에 대한 자동 분해 활동을 제한하는 변형 트립신을 제공합니다.미변성 트립신은 35°C에서 45°C 사이에서 가장 높은 활성을 보인다.개조가 완료되면 최적온도를 50°C~55°[16][26]C 범위로 변경한다.겔 내 소화에 사용되는 다른 효소로는 엔도프로테아제 Lys-C,[27][28][29] Glu-C,[30][31][32] Asp-N[33] [34][35]및 Lys-N이 있다.이러한 단백질 분해 효소는 특정 아미노산 한 개만 절단합니다.Asp-N은 아스파라긴산의 [27]n말단을 절단한다.따라서 더 적은 수의 더 긴 펩타이드를 얻을 수 있다.

단백질 분해효소 하나만 사용하여 단백질의 완전한 1차 배열을 분석하는 것은 일반적으로 불가능하다.이러한 경우 서로 다른 효소를 사용하는 여러 접근법에서 표적 단백질의 소화가 권장된다.결과적인 중복 펩타이드는 단백질의 [30][36][37]전체 염기서열을 조립할 수 있게 한다.

소화를 위해 겔의 매트릭스에 고정된 단백질은 단백질 분해 효소에 접근할 수 있어야 한다.겔에 대한 효소의 침투는 아세토니트릴로 처리함으로써 겔 조각의 탈수 및 단백질 분해효소를 포함하는 소화 완충제의 후속 붓기에 의해 촉진되는 것으로 여겨진다.이 절차는 단백질 분해 효소가 [2]팽창 과정에 의해 겔에 침투한다는 가정에 의존합니다.겔에 효소가 침투하는 것에 대한 다른 연구는 그 과정이 거의 완전히 확산에 의해 움직이는 것을 보여주었다.겔의 건조는 [7][16]이 과정을 지원하지 않는 것 같습니다.따라서 겔 내 소화의 개선은 예를 들어 겔을 가능한 한 작게 절단함으로써 효소의 기질화 방법을 감소시킴으로써 달성되어야 한다.

보통 겔 내 소화는 밤샘 과정으로 진행됩니다.단백질 분해 효소로 트립신을 사용하고 37°C의 온도에서 대부분의 프로토콜에서 발견되는 배양 시간은 12-15시간입니다.그러나 소화 과정의 지속 시간에 대한 실험은 3시간 후 성공적인 질량 분광 [38]분석을 위한 충분한 재료가 있음을 보여주었다.또한 온도 및 pH에서 단백질 분해효소에 대한 조건을 최적화하면 시료의 소화가 30분 [16]이내에 완료될 수 있다.

계면활성제(디테리먼트)는 겔 내 단백질의 가용화 및 변성을 촉진하여 소화시간을 단축하고 단백질 분해 및 추출된 펩타이드의 수 및 양을 증가시킬 수 있으며, 특히 막단백질과 같은 친유성 단백질의 경우 더욱 그러하다.분해성 세제는 소화 후에 분해되는 세제로, 종종 산성 조건에서 분해됩니다.따라서 질량 분석과 호환되는 세제를 추가할 수 있습니다.

추출.

소화가 완료된 후 이 과정에서 생성된 펩타이드를 겔 매트릭스에서 추출해야 합니다.이 작업은 하나 이상의 추출 단계를 통해 수행됩니다.겔 입자를 추출 용액으로 배양하여 상등액을 채취합니다.첫 번째 추출에서는 거의 모든 펩타이드를 회수하고 추출 공정을 반복함으로써 전체 공정의 수율을 5~10%[10]만 높일 수 있다.물리적, 화학적 특성이 다른 펩타이드의 요건을 충족하기 위해 염기성 용액 또는 산성 용액을 사용하여 반복 추출을 수행한다.산성펩타이드의 추출에는 소화완충제의 농도 및 조성과 유사한 용액을 사용하며, ESI용 포름산 저농도 산성용액과 MALDI용 트리플루오로아세트산을 각각 사용하여 목적 질량분석법에 따라 염기성펩타이드를 추출한다.모델 단백질에 대한 연구는 [10]겔에서 추출하여 예상 펩타이드 수율의 약 70~80%를 회복하는 것을 보여주었다.많은 프로토콜은 30%(v/v) 이상의 농도로 반응 튜브 및 피펫 [39]팁 표면에 대한 펩타이드의 흡착을 감소시키는 데 효과적인 추출 용액에 대한 아세토니트릴의 추가 분율을 포함하고 있다.고인 추출물의 액체는 원심 증발기에서 증발됩니다.염기 추출에 휘발성 중탄산염 암모늄을 사용한 경우에는 건조 과정에서 부분적으로 제거한다.건조된 펩타이드는 -20 °C에서 최소 6개월간 보관할 수 있다.

중요한 고려사항과 실제 동향

겔 내 소화를 위한 공통 프로토콜의 몇 가지 주요 결점은 긴 시간과 여러 처리 단계이며, 오염(특히 케라틴)에 관해 방법이 오류를 일으키기 쉽습니다.이러한 단점은 최적화된 프로토콜과 특수 반응 [7]튜브의 개발에 의해 대부분 제거되었다.

취급의 어려움보다 더 심각한 것은 샘플 처리 중 재료의 손실입니다.질량 분석 단백질 분석은 종종 검출 한계에서 수행되기 때문에 작은 손실이라도 전체 분석의 성공 또는 실패를 좌우할 수 있다.이러한 손실은 다양한 처리 단계에서의 세척, 반응 튜브 및 피펫 팁 표면으로의 흡착, 겔에서 펩타이드의 불완전한 추출 및/또는 질량 분석계에서 [10][40]단일 펩타이드의 이온화 불량으로 인해 발생한다.펩타이드의 물리화학적 특성에 따라 손실은 15~50% 사이에서 달라질 수 있습니다.펩타이드의 내재적 이질성으로 인해, 지금까지 이 방법의 주요 결점에 대한 보편적 유효한 용액은 발견되지 않았다.

상업용 실장

인겔 소화의 상업적 구현은 높은 처리량과 낮은 처리량 실험실용 제품으로 구분되어야 합니다.

높은 스루풋

시간이 많이 걸리고 작업 집약적인 표준 시술로 인해, 인겔 소화 방법은 한 번에 처리할 단백질 스팟의 비교적 적은 수로 제한되었다.따라서 산업 및 서비스 [41]연구소에서 이러한 한계를 극복하려는 자동화의 야망에 이상적인 대상으로 판명되었습니다.오늘날, 겔 내 소화가 높은 처리량으로 수행되는 실험실에서는 절차가 일반적으로 자동화됩니다.자동화 정도는 단순한 피펫팅 로봇에서 매우 정교한 일체형 솔루션에 이르기까지 다양하며, 젤에서 질량 분석까지 자동화된 워크플로우를 제공합니다.시스템은 보통 스폿 피커, 소화 로봇 및 스팟터로 구성됩니다.

한 번에 처리할 스폿 수가 많은 것 외에 자동화의 장점은 수작업의 감소와 표준화 개선입니다.이 방법의 취급 단계는 다양하기 때문에 수동 공정의 결과는 사용자의 손재주에 따라 다를 수 있으며 오염 위험이 높습니다.따라서 결과의 품질은 자동화된 [42]공정의 주요 장점 중 하나로 설명됩니다.

자동화 솔루션의 단점은 로봇, 유지보수 및 소모품 비용과 복잡한 프로세스 설정입니다.자동 피킹에는 스폿 위치의 디지털 정보가 필요하므로 관련 스폿에 대한 겔 이미지의 분석은 표준화된 이미징 방법과 특수 스캐너가 필요한 소프트웨어로 수행해야 합니다.이렇게 긴 절차로 인해 연구자는 단일 젤에서 몇 개의 흥미로운 지점을 자발적으로 식별할 수 없을 뿐만 아니라 시스템을 최대 용량으로 작동시킬 필요도 없습니다.후속 자동 MS 분석의 결과 데이터 양은 높은 throughput 시스템의 또 다른 문제입니다.그것은, 그 품질에 의구심이 드는 경우가 많고, 이러한 데이터의 평가에는 수집보다 [43][44]큰 시간이 걸리기 때문입니다.

저스루풋

언급된 단점은 자동화된 겔 내 소화 시스템의 합리적인 사용을 일상적인 실험실로 제한하는 반면, 단백질 식별 기구를 보다 유연하게 사용할 것을 요구하는 연구소는 종종 겔 내 소화 및 MS 분석을 위한 수동의 낮은 처리량 방법을 고수한다.이 고객 그룹은 인겔 소화용 여러 키트 시스템을 사용하는 업계의 타깃입니다.

대부분의 키트 시스템은 겔 내 소화에 필요한 화학 물질과 효소의 단순한 집합이지만 기본 프로토콜은 위에서 설명한 수동 표준 절차와 변경되지 않습니다.경험이 없는 고객에게 이러한 제품의 장점은 프로세스를 위한 기성 프로토콜과 함께 다양한 솔루션의 기능이 보장된다는 것입니다.

몇몇 회사는 수동 샘플 준비 작업에서도 보다 쉽고 표준화된 워크플로우를 가능하게 하기 위해 인겔 소화 처리 프로세스를 개선하려고 노력했습니다.Millipore의 Montage In-Gel Digest Kit는 표준 프로토콜을 기반으로 하지만 수정된 96웰 마이크로 플레이트로 겔 조각을 처리하여 다수의 병렬 검체를 처리할 수 있습니다.겔 내 소화의 다양한 단계에 대한 용액은 이 플레이트의 웰에 파이프로 연결되며, 액체는 진공 펌프에 의해 웰의 바닥을 통해 제거됩니다.이 시스템은 멀티채널 피펫과 심지어 피펫 로봇을 사용하여 여러 피펫 단계를 간편하게 처리합니다.실제로 일부 고처리량 시스템 제조업체는 로봇과 함께 작동하기 위해 이 시스템을 채택했습니다.이것은 샘플 수가 많은 실험실에 대한 이 키트 솔루션의 방향을 보여줍니다.

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외부 링크

  • 그란보글 등에 설명된 대로 최적화된 겔 내 소화 실험 절차를 설명하는 플래시 필름.

「 」를 참조해 주세요.

  • Zymography, 분자생물학에서 전기영동겔에서 단백질의 소화를 수반하는 관련 없는 기술