트랜스라토믹스

Translatomics
트랜스텀은 폴리섬 프로파일링, 리보솜 풋프린트, TRAP-seq, RNC-seq 및 기타 트랜스라토믹스 기술을 사용하여 특징지어집니다.BioRender.com에서 작성되었습니다.

트랜스라토믹스는 세포나 유기체에서 활발하게 번역되고 있는 모든 ORF(Open Reading Frame)에 대한 연구입니다.이 ORF 컬렉션은 트랜스텀이라고 불립니다.세포의 트랜스텀을 특징짓는 것은 세포 내에서 활성화된 생물학적 경로의 배열에 대한 통찰력을 줄 수 있다.분자생물학의 중심 교의에 따르면, 세포의 DNA는 RNA를 생성하기 위해 전사되고, RNA는 단백질을 생성하기 위해 번역됩니다.수천 개의 단백질이 유기체의 게놈에 암호화되어 있고, 세포에 존재하는 단백질은 세포의 생명을 지탱하는 많은 기능을 공동으로 수행한다.스트레스나 발달의 특정 시점과 같은 다양한 조건에서, 세포는 활성화되기 위해 다른 생물학적 경로를 필요로 할 수 있으며, 따라서 다른 단백질의 수집을 필요로 할 수 있다.내재적 및 환경적 조건에 따라, 한 번에 만들어지는 단백질의 수집은 달라진다.변환 원자 기술은 능동적으로 번역되는 ORF 모음의 "스냅샷"을 찍기 위해 사용될 수 있으며, 이는 세포가 현재 [1]조건에서 활성화되는 생물학적 경로에 대한 정보를 제공할 수 있다.

보통 리보솜 프로파일링 기술은 트랜스텀 정보를 [2]얻기 위해 사용된다.다른 방법으로는 폴리썸프로파일링, 전장변환mRNA프로파일링(RNC-seq) 및 변환리보솜 어피니티 정제(TRAP-seq)[3]가 있습니다.트랜스라톰은 트랜스라톰과 트랜스라톰의 상관관계가 트랜스라톰과 트랜스라톰의 [4]상관관계보다 높기 때문에 일부 유전자의 발현수준을 추정하기 위한 보다 정확한 근사치이다.

역사

인간 게놈 프로젝트의 완성에 가까워지면서 유전학 분야는 유전자의 기능을 결정하는 쪽으로 초점을 옮기고 있었다.이것은 RNA와 세포의 단백질과 같은 다른 생물학적 물질들의 모음들을 분류하는 것을 포함했다.이러한 물질의 컬렉션은 -omes라고 불리며, 인간 게놈의 염기서열 분석을 둘러싼 광범위한 흥분을 불러일으켰다.트랜스라톰이라는 용어는 2001년 그린바움 등에 의해 처음 제안되었다.[5]트랜스라톰은 단백질의 상대적인 양을 설명하기 위한 것이었다.트랜스라톰이라는 용어는 일반적으로 세포에서 활발하게 만들어지는 단백질의 수집을 말한다.트랜스라토믹스는 데그라도믹스와 결합하여 다양한 조건에서 단백질로의 순변화를 설명하는 것을 목표로 한다.

omics와의 관련성 및 기여

유전체학의 목적은 유전체, 즉 유기체의 유전 물질 수집을 연구하는 것이다.유전체 서브필드 또는 Transcriptomics 및 proteomics와 같은 다른 -omics는 다른 조건에서 게놈의 생성물(RNA 및 단백질)을 정량화함으로써 게놈 기능을 특징짓는 것을 목표로 한다.그렇게 함으로써, 오믹스는 유전자 발현 조절의 다른 수준에 대한 통찰력을 얻고, 따라서 게놈 기능을 한다.그러나 이러한 분야는 이미 형성된 생체 분자의 특성을 나타낸다.어떤 경우에, RNA나 단백질의 풍부함은 기능을 반영하지 않는다. 왜냐하면 이러한 생체 분자들은 빠르게 분해될 수 있기 때문이다. 또는 그들이 처음 합성된 후 오랫동안 세포에 남아있을 수 있기 때문이다.프로테옴을 연구하기 위해 프로테오믹스 기술을 사용할 때, 번역 후 변형 및 단백질 분해 수준에서 단백질 풍부성의 조절은 이전의 조절 과정을 모호하게 할 수 있다.세포 기능은 종종 번역 수준에서 조절되기 때문에, 즉, 트랜스크립텀이 항상 게놈 [1]기능을 반영하는 것은 아니기 때문에, 트랜스포토믹스 기술을 사용하여 트랜스포토믹스나 프로테오믹스 연구에서 가려질 수 있는 게놈 기능의 조절을 관찰할 수 있다.

방법들

mRNA Messenger RNA 번역

대부분의 트랜스라토믹스 기술은 리보솜과 복합된 mRNA를 특징짓는 데 중점을 두고 있으며, 따라서 번역된다.

폴리썸 프로파일링

폴리썸 프로파일링은 하나 이상의 mRNA의 번역 정도를 특징짓기 위해 사용되는 기술입니다.고도로 번역된 mRNA는 폴리솜으로 존재하며, 이는 다중 리보솜과 복합화됨을 의미한다. 낮은 수준에서 변환된 mRNA는 더 적은 리보솜으로 복합화된다.폴리썸 프로파일링에서 수크로스 구배는 크기에 [6]따라 세포 용해액 중의 분자 복합체를 분리하기 위해 사용된다.열의 분율은 시퀀스 또는 다른 방법으로 분석됩니다.mRNA의 번역률은 mRNA의 검출과 저분자량 및 고분자량 비율의 풍부성에 기초하여 결정된다.

RNC-seq

전장 변환 mRNA(RNC-seq)는 수크로스 쿠션에서 용해된 샘플을 원심 분리하는 것을 포함한다.이를 통해 리보솜-나사슬복합체(RNC)를 자유 mRNA 및 기타 세포 성분으로부터 분리할 수 있습니다.RNC는 원심분리 시 펠릿을 형성하며 추가 분석을 위해 수집됩니다.이러한 RNC에서 변환되는 mRNA는 시퀀스를 통해 변환되는 [1][7]mRNA의 식별과 정량화가 가능합니다.그러나 RNC-mRNA 복합체는 연약하기 때문에 리보솜이 mRNA에서 분리되고 mRNA가 분해되어 [1]수집된 결과를 바이어스화시킬 수 있다.

리보세크/리보솜 프로파일링/리보솜 풋프린팅

리보솜 프로파일링에서 폴리솜을 포함한 세포 mRNA는 RNA를 분해하는 효소인 리보핵산가수분해효소를 받는다.리보솜에 의해 결합된 RNA 분자의 위치는 소화로부터 보호된다.리보핵산가수분해효소 활성 중단 후, 이러한 보호된 부위는 복구되고 배열될 수 있다.따라서 ribo-seq에서 얻은 시퀀스는 능동적으로 [8]변환되고 있는mRNA의 fragment를 나타냅니다.

TRAP-seq

TRAP-seq는 조직 또는 다른 종류의 세포 내에서 특정 세포 유형으로 활발하게 번역되는 mRNA를 식별하기 위해 사용된다.관심 세포 유형은 녹색 형광 [9]단백질과 같은 에피토프 태그에 융합된 리보솜 서브유닛을 발현하도록 설계되었다.세포용해 후 에피토프를 표적으로 하는 항체는 융합단백질을 포함한 리보솜에 결합하는 mRNA를 분리하기 위해 사용된다.이 RNA는 cDNA로 변환되어 배열됩니다.이 기술은 특히 관심 세포 유형으로 변환된 mRNA를 식별합니다.

초기 폴리펩티드

폴딩 상태

질량 분석

질량 분석 방법으로는 초기 폴리펩타이드 접힘을 결정할 수 없다.현재 세포 내에서 초기 폴리펩타이드의 접힘 상태를 전체적으로 검사하는 방법은 없습니다.각각의 초기 폴리펩타이드의 [1]접힘 상태를 검사하는 방법이 있다.

한 가지 방법은 초기 펩타이드를 저온에서 절단하기 위해 비특이적 단백질 분해효소를 사용한다.단백질 분해 효소는 펴지고 유연한 영역을 절단할 수 있지만 단단히 접힌 영역을 절단할 수는 없습니다.그런 다음 분할의 산물을 분리하여 초기 [1][10]펩타이드의 접힌 영역을 결정하기 위해 연구할 수 있다.

핵자기 공명

초기 폴리펩타이드의 전체 구조를 분석하기 위해 핵자기공명(NMR)을 사용한다.NMR은 용액 내 분자를 동적으로 볼 수 있도록 하기 때문에 리보솜-나사슬 복합체(RNC)에 사용할 수 있습니다.리보솜의 라벨 부착을 통해 의심되는 리보솜 신호에 대해 NMR 데이터를 필터링하고 초기 폴리펩타이드의 [11]신호를 식별할 수 있다.

식별 및 정량화

초기 폴리펩타이드의 구조는 현재 전 세계적으로 오염될 수 없지만, 동정과 정량화는 그렇지 않다.

세포배양 중 아미노산에 의한 안정적인 동위원소 표시

한 가지 방법은 세포 배양 내 아미노산에 의한 안정 동위원소 라벨링(SILAC)의 변형을 사용한다.SILAC는 정량화를 위해 라벨이 부착된 펩타이드와 라벨이 부착되지 않은 펩타이드를 비교하여 정량화를 가능하게 하는 안정적인 동위원소로 단백질을 라벨링한다.Pulse SILAC(pSILAC)는 펄스 중에 생성된 펩타이드만 라벨링할 수 있습니다.이론적으로, 이것은 정량화를 위한 초기 펩타이드만 포획할 수 있게 한다.그러나 SILAC는 정확한 정량화를 위해 유사한 수준의 라벨이 부착된 단백질과 라벨이 부착되지 않은 단백질을 필요로 한다.따라서 pSILAC 펄스는 번역 과정보다 훨씬 더 오래 실행되어야 하므로 초기 펩타이드의 정량화가 [1][12]부정확합니다.

생체직교/정량 비표준 아미노산 태그 부착

바이오 직교/정량 비표준 아미노산 태깅(BONCAT/QuaNCAT)은 단백질에 태그를 붙이기 위해 아지도호모알라닌(AHA)을 사용한다.이것은 [13][14]MS를 위해 새롭게 생성된 단백질의 분리를 가능하게 한다. 그러나, AHA를 사용하려면 세포 내 메티오닌의 사전 주입과 AHA의 도입이 필요하며, 세포를 강조하고 잠재적으로 내부 번역 역학을 변화시킨다.pSILAC와 마찬가지로 AHA 방법은 더 긴 펄스를 요구하므로 초기 펩타이드를 [1][12]정량화하는 데 효과가 제한된다.

푸로마이신 관련 초기사슬단백질학

퓨로마이신 관련 신생 펩타이드를 포착하기 위해 퓨로마이신-비오틴 라벨을 사용한다. 그러나 세포 과정을 방해하지는 않지만 신생 펩타이드를 [1][12]검출하는 다른 방법보다 덜 민감하다.이러한 정량화 방법 외에, 다른 MS 기반 방법도 개발되고 있습니다.

mRNA의 열화

mRNA의 열화도 번역 프로세스를 규제하는 데 중요한 역할을 합니다.

붕괴 메커니즘을 탐색하기 위해, 캡 해제 및 절단되지 않은 전사(GMUT), RNA 단부의 병렬 분석(PARE) 및 데그라돔 염기서열 분석의 게놈 전체 매핑은 캡 해제된 mRNA의 염기서열 분석 플랫폼의 T4 연결 효소를 사용합니다.T4 연결효소는 RNA에서 유리 5' 1인산과 결합한다.성숙한 mRNA는 5'의 캡을 가지므로 기질로 결합되지 않고 탈캡되어 분해된 mRNA가 [15]결합된다.

5'-단인산 엔드 시퀀싱(5Pseq)은 성숙 mRNA 및 분해된 제품의 시퀀싱을 가능하게 하기 위해 캡 및 캡 해제된 시퀀스를 모두 캡처한다.이는 mRNA 분해 생성물을 식별하는 데 도움이 되며 리보솜 [1][16]지연을 연구하는 데 사용됩니다.

이 방법들은 5' ~ 3' 분해, miRNA 매개 분할, 난센스 매개 mRNA 붕괴를 연구하지만 3' ~ 5' 분해 및 기타 분해 메커니즘을 측정할 수는 없다.

생체내 번역 추적

위의 기술은 세포의 용해가 필요하기 때문에 살아있는 세포에서는 수행할 수 없습니다.단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 및 Nasent 체인 추적(NCT)은 형광을 사용하여 번역 활동을 추적합니다.두 방법 모두 단일 mRNA에서 [17][18]폴리펩타이드의 신장률을 추적한다.그러나 어느 기술도 높은 throughput을 [1]제공할 수 없습니다.

tRNAOM

Transfer RNA(tRNA)는 번역의 중요한 부분입니다.tRNA는 mRNA를 읽고 리보솜이 조립하는 아미노산을 폴리펩타이드로 가져옵니다.따라서 tRNA의 양과 종류는 단백질 합성 [19]속도에 큰 영향을 미친다. tRNA는 다른 tRNA와 매우 유사할 수 있으며, 일부 tRNA 종은 단일 뉴클레오티드에 의해서만 다르다.이는 유사한 2차 및 3차 구조와 결합되어 서로 다른 tRNA 종을 분리하는 [1]것을 어렵게 한다.

겔 전기영동

2D-Gel 전기영동은 tRNA 분리에 사용되는 전형적인 방법이다.처음에 tRNA는 7M 요소에서 변성되어 제1의 겔 치수로 분리되며, 4M 요소에서는 부분 리폴딩이 가능하여 제2의 겔 치수로 추가로 분리된다.이 방법은 대장균에서 48세트와 B. 서브틸리스에서 30세트로 분리할 수 있지만 분해능은 제한적이다.269마리의 [20]랫드 tRNA에 대해 62개의 반점만 발견되어 많은 다른 tRNA 종들은 2D-겔 전기영동으로 완전히 분리될 수 없다.

액체 크로마토그래피

아미노아실화 tRNA 이소수용체에 기초한 tRNA를 분리하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피를 사용할 수 있다.이 방법은 tRNA 종을 완전히 분리할 수 없고 코돈을 구별할 수 없지만, 여전히 다른 [20]세포주 사이의 양적 차이를 발견할 수 있다.

질량 분석

질량분석법(MS)은 고유한 핵산가수분해효소 소화 [21]생성물에 기초한 tRNA를 분리하기 위해 사용될 수 있다.그러나 이것은 30 tRNA 종의 혼합물에 대한 분해능이 제한적이며, 더 큰 tRNA 그룹에서 MS에 앞서 분화가 필요하다.또한 tRNA [20]종의 소화 패턴에 대한 사전 지식이 필요하기 때문에 deNovo tRNA 종의 식별에도 사용할 수 없습니다.

마이크로어레이

하이브리드화 기반 마이크로어레이는 tRNA에서 3'CCA 보존 배열을 사용하여 형광 탐촉자를 부착합니다.tRNA의 길이를 덮는 70~80개의 뉴클레오티드 긴 프로브를 사용하여 tRNA를 결합한다.최소 8개의 염기 차이를 가진 tRNA는 마이크로어레이로 구별할 수 있지만 차이가 작은 tRNA는 동일한 [20]프로브에 결합한다.

양적 역문자 변환

양적 역전사, 실시간 PCR(qRT-PCR)은 tRNAome을 식별하고 정량화하기 위한 또 다른 방법이다.보존된 3'CCA 배열을 위한 프라이머는 모든 tRNA종의 역전사를 프라이밍하기 위해 사용된다.tRNA 뉴클레오티드의 대폭적인 변형과 tRNA 분자의 안정성이 문제가 될 수 있으므로, 이에 대응하기 위해 고온과 탈메틸화가 사용되어 왔다.디메틸화는 또한 [1]배열에서 메틸화가 유도하는 오류를 상쇄하기 위해 사용되어 왔다.

Ribo-seq처럼

리보-tRNA-seq는 tRNA의 역할을 번역에 보다 가깝게 관찰하기 위해 개발되었습니다.Ribo-seq와 유사하게, Ribo-tRNA-seq는 배열하기[22] 전에 라이브러리 준비를 위해 리보솜에서 tRNA 분자를 포착한다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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