폴리썸 프로파일링

Polysome profiling
폴리솜

폴리썸 프로파일링은 분자생물학에서 mRNA와 리보솜의 연관성을 연구하는데 사용되는 기술이다.이 기법은 리보솜 프로파일링과는 다르다는 점에 유의해야 합니다.두 기술은 모두 검토되었으며[1] 트랜스폼 분석에 사용되지만, 생성된 데이터는 매우 다른 수준의 특이성을 가지고 있습니다.전문가에 의해 사용되는 경우, 이 기술은 매우 재현할 수 있습니다. 첫 번째 영상의 3가지 프로파일은 3가지 다른 실험에서 [2]얻은 것입니다.

순서

시술은 관심 세포의 용액을 만드는 것으로 시작합니다.이 용해물은 폴리솜, 모노솜(mRNA에 존재하는 하나의 리보솜으로 구성됨), 작은 리보솜 서브유닛(진핵생물에서는 40S), 그리고 큰 리보솜 서브유닛(진핵생물에서는 60S), "자유" mRNA 및 다수의 수용성 세포 성분을 포함합니다.

이 절차는 원심분리 튜브에서 연속적으로 가변적인 밀도의 수크로스 구배를 만드는 것으로 계속됩니다.사용된 농도(예에서 15-45%)에서 수크로스는 리보솜과 mRNA의 결합을 방해하지 않는다.경사의 15% 부분은 튜브의 맨 위에 있는 반면 45% 부분은 밀도가 다르기 때문에 맨 아래에 있습니다.

다음으로 특정량의 리세이트(광학적 밀도로 측정)를 튜브 내 구배 위에 완만하게 적층한다.용해물은 다량의 수용성 물질을 포함하지만 15%의 수크로스보다 밀도가 훨씬 낮기 때문에 부드럽게 하면 튜브 상부에 별도의 층으로 유지할 수 있다.

용융액의 성분을 분리하기 위해 원심분리한다.이것은 중력의 몇 배에 달하는 힘으로 용해액의 구성 요소를 가속시키고, 따라서 개별 구성 요소의 "크기"에 따라 구배를 통해 추진합니다.소형(40S) 서브유닛은 대형(60S) 서브유닛보다 구배 내로 덜 이동합니다.mRNA 상의 80S 리봄은 더 멀리 이동한다(이동 거리에 대한 mRNA 크기의 기여는 유의하지 않음).2개의 리보솜으로 구성된 폴리솜은 더 멀리 이동하고, 3개의 리보솜을 가진 폴리솜은 더 멀리 이동하고, 계속해서 이동합니다.구성 요소의 "크기"는 svedberg 단위인 S에 의해 지정됩니다.1 S = 10초이며−13, "big"의 개념은 사실 지나치게 단순화된 것입니다.

자당구배 및 면역블롯

원심분리 후 튜브의 내용물을 위쪽(작은, 느린 주행)에서 아래쪽(큰, 빠른 주행)까지의 분수로 수집하여 분율의 광학 밀도를 구한다.제거된 첫 번째 분자는 tRNA, 개별 단백질 등과 같이 비교적 작은 분자를 다량 가지고 있다.

적용들

이[3][4][5] 기술을 세포에서 번역의 전반적인 정도를 연구하기 위해 사용하는 것은 가능하지만, 그것은 훨씬 더 구체적으로 개별 단백질과 그들의 mRNA를 연구하는데 사용될 수 있다.그림 하부의 예로서 작은 서브유닛의 일부를 구성하는 단백질을 먼저 40S 분율에서 검출한 후 60S 분율에서 거의 소실(이들 구배에서의 분리는 절대적이지 않음)된 후 80S 분율 및 폴리섬 분율에서 다시 나타날 수 있다.이것은 작은 서브유닛의 일부가 아닌 세포에서 발견된 단백질이 기껏해야 거의 없다는 것을 나타냅니다.이와는 대조적으로 면역블롯 그림의 윗줄에는 가용성 단백질이 용해분수에 나타나며 리보솜 및 폴리솜과 관련된다.특정 단백질은 샤페론 단백질로, 리보솜에서 추출되는 초기 펩타이드를 접는 데 도움이 됩니다.다른 일과 마찬가지로

PolysomesmRNA.jpg

그 논문에서, [2]리보솜과 샤페론의 직접적인 연관성이 나타났다.

이 기술은 또한 특정 mRNA의 번역 정도를 연구하는데 사용될 수 있다. 이러한 실험에서, mRNA의 5'와 3' 시퀀스는 생성된 mRNA의 양과 mRNA가 얼마나 잘 번역되는지에 대한 영향을 위해 조사되었다.이와 같이 모든 mRNA 아이소폼이 코드 배열이 [6]동일하더라도 동일한 효율로 번역되는 것은 아니다.

레퍼런스

  1. ^ Piccirillo, CA; et al. (2014). "Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes". Nature Immunology. 15 (6): 503–511. doi:10.1038/ni.2891. PMID 24840981. S2CID 6269940.
  2. ^ a b Hanebuth, MA; et al. (2016). "Multivalent contacts of the Hsp70 Ssb contribute to its architecture on ribosomes and nascent chain interaction". Nature Communications. 7: 13695. Bibcode:2016NatCo...713695H. doi:10.1038/ncomms13695. PMC 5150220. PMID 27917864.
  3. ^ Lin, CJ; et al. (2010). "The antidepressant sertraline inhibits translation initiation by curtailing mammalian target of rapamycin signaling". Cancer Research. 70 (8): 3199–3208. doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4072. PMID 20354178.
  4. ^ Coudert, L; et al. (2014). "Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling". Journal of Visualized Experiments (87). doi:10.3791/51164. PMC 4193336. PMID 24893838.
  5. ^ Molon, M; et al. (2016). "The rate of metabolism as a factor determining longevity of the Saccharomyces cerevisiae yeast". Age (Dordrecht, Netherlands). 38 (1): 11. doi:10.1007/s11357-015-9868-8. PMC 5005888. PMID 26783001.
  6. ^ a b Floor, SN; Doudna, JA (2016). "Tunable protein synthesis by transcript isoforms in human cells". eLife. 5. doi:10.7554/eLife.10921. PMC 4764583. PMID 26735365.