근접 라벨

Proximity labeling
미토콘드리아 외막 단백질은 근접 라벨을 통해 식별된다.

근접 기반 라벨링으로도 알려진 효소 촉매 근접 라벨링(PL)은 관심 있는 단백질에 근접한 생체 분자,[1] 보통 단백질 또는 RNA를 라벨링하는 실험실 기술이다.대상 단백질과 공학적 라벨링 효소 사이에 살아있는 세포에 유전자 융합을 생성함으로써 대상 단백질에 공간적으로 근접한 생체분자를 선택적으로 비오틴으로 마크하여 풀다운 및 분석할 수 있다.근접 라벨링은 새로운 세포 구조의 구성 요소를 식별하고 단백질-단백질 상호작용 파트너를 결정하기 위해, 그리고 다른 [2]응용 프로그램들 중에서 사용되었다.

역사

근접성 라벨링 개발 전 세포 내 단백질 근접성 결정은 친화성 정제 질량 분석 및 근접성 결합 [3]분석 등의 방법을 통한 단백질-단백질 상호작용 연구에 의존했다.

DamID는 Steven Henikoff에 의해 2000년에 개발된 방법으로 관심 있는 염색질 단백질에 근접한 게놈의 일부를 식별하기 위해 개발되었습니다.DamID는 염색질 단백질에 대한 DNA 메틸전달효소 융합에 의존하여 비자연적으로 DNA를 메틸화하며,[4] 그 후 단백질 근처의 게놈 메틸화 부위를 밝히기 위해 배열될 수 있다.연구자들은 DamID의 융합 단백질 전략에 따라 단백질 표적의 부위별 라벨링 방법을 만들어 비오틴 단백질 라벨링 기반 Bio를 만들었다.2012년 [1]아이디스탠포드 대학의 Alice Ting과 Ting 연구소는 비오틴 기반의 근접 라벨링 효과와 [5][6][7][8]속도를 향상시키는 몇 가지 단백질을 개발했습니다.

원칙

근접 표시는 주변의 생체 분자를 무질서하게 비오티닐화 할 수 있는 표시 효소에 의존합니다.비오틴 라벨링은 라벨링 효소의 종류에 따라 몇 가지 다른 방법을 통해 달성될 수 있다.

  • BirA*로도 알려진 BioID는 ATP에 의한 비오틴 활성화를 촉매하는 돌연변이 대장균 비오틴 연결효소이다.활성화된 비오틴은 수명이 짧기 때문에 BioID에 근접한 영역에만 확산될 수 있다.라벨링은 활성화된 비오틴이 [1]단백질에서 발견되는 리신 측쇄 아민과 같은 인근 아민과 반응할 때 달성된다.TurboID는 효모 표면 표시 방향 진화를 통해 제조된 비오틴 연결효소입니다.TurboID는 Bio가 요구하는 최대 18시간의 라벨링 시간을 10분으로 단축아이디[5]
  • 에이펙스는 비오틴-페놀이라고도 알려진 비오틴-티라미드를 단수명 반응성 비오틴-페놀 유리기로의 산화를 촉매하기 위해 과산화수소에 의존하는 아스코르브산 페르옥시다아제 유도체이다.라벨링은 이 중간체가 인근 생체분자의 다양한 기능군과 반응할 때 달성된다.APEX는 전자현미경 염색의 전구체인 디아미노벤지딘의 국소 침착에도 사용될 수 있다.APEX2는 효모 표면 표시 방향 진화를 통해 엔지니어링된 APEX의 파생물이다.APEX2는 향상된 라벨링 효율성과 세포 발현 [8]수준을 보여줍니다.

관심 단백질 근처에 있는 단백질에 라벨을 붙이기 위해, 일반적인 근접 라벨링 실험은 관심 단백질에 대한 관심 단백질에 대한 APEX2 융합의 세포 발현으로 시작됩니다.세포는 다음으로 비오틴-페놀로 배양된 후, 잠시 과산화수소로 배양되어 비오틴-페놀 유리기의 생성과 표기를 시작한다.세포 손상을 최소화하기 위해, 반응은 항산화 완충제를 사용하여 담금질된다.세포는 분해되고 라벨이 붙은 단백질은 스트렙타비딘 비즈로 제거된다.단백질은 트립신에 의해 소화되며, 마지막으로 LC-MS/[8]MS 또는 SPS-MS와3 같은 산탄총 프로테오믹스 방법을 사용하여 펩티드 단편을 분석한다.

대신 단백질 융합이 유전적으로 접근할 수 없지만(예를 들어 인체 조직 샘플에서)[9][10] 관심 단백질에 대한 항체가 알려진 경우, 라벨링 효소와 항체를 융합한 다음 샘플과의 융합을 배양함으로써 근접 라벨링이 여전히 가능하다.

적용들

근접 라벨링 방법은 [11]섬모, 미토콘드리아,[6] 시냅스 후 [2]균열, p-body, 스트레스 [12]과립, 지질 [13]방울과 같이 순수하고 완전하게 분리하기 어려운 생물학적 구조의 프로테옴을 연구하기 위해 사용되어 왔다.

APEC2와 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 융합은 20초 동안의 시간[14] 분해능에서 GPCR 시그널링을 추적하고 알려지지 않은 GPCR 연결 [15]단백질의 식별을 가능하게 한다.

근접 라벨링은 또한 전사체학 및 인터랙토믹스에도 사용되어 왔다.2019년 Alice Ting과 Ting 연구소는 특정 세포 [16][17]구획에 국소화된 RNA를 식별하기 위해 APEX를 사용했다.2019년 바이오ID는 베타-액틴 mRNA 전사물에 결합되어 국재 [18]역학을 연구하였다.근접 라벨링은 또한 헤테로다이머 단백질 포스파타아제, miRISC(마이크로RNA 유도 사일런싱 복합체) 단백질 Ago2 및 [3]리보핵단백질의 상호작용 파트너를 찾기 위해 사용되어 왔다.

최근의 동향

TurboID 기반 근접 라벨링은 선천적 면역 반응에 관여하는 수용체, 즉 NOD 유사 [19]수용체를 식별하기 위해 사용되어 왔다.전이에 [20]중요한 유방암 세포 인바도포디아의 분자조성을 식별하기 위해 바이오ID 기반 근접표시가 사용되었습니다.비오틴 기반 근접 라벨링 연구는 본질적으로 무질서한 영역의 단백질 태깅 증가를 보여주며, 비오틴 기반 근접 라벨링이 IDR의 [21]역할을 연구하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.또한 광활성화 근접 [22]라벨링을 위해 광증감제 핵 표적 소분자가 개발되었다.

광촉매 기반 근접 라벨

근접성 라벨링 분야의 새로운 프런티어는 근위 단백질 [23]미세환경의 높은 공간적 및 시간적 분해능을 달성하기 위해 광촉매의 효용성을 이용한다.이 광촉매 기술은 이리듐 기반 광촉매의 광전자 에너지를 이용하여 약 4나노미터의 [24]좁은 반경 내에서 근접 단백질에 태그를 붙일 수 있는 디아지린 탐침을 활성화한다.이 기술은 프린스턴 [24]대학 연구진과 함께 머크 탐사 과학 센터에 의해 개발되었습니다.

레퍼런스

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