라이브러리 (생물학)

Library (biology)
사이트 포화 돌연변이 유발은 사이트 지향 돌연변이 유발의 한 종류입니다.이 이미지는 이론적인 10-잔류 단백질에서 단일 위치의 포화 돌연변이 유발을 보여줍니다.단백질의 야생형 버전은 맨 위에 표시되며, M은 첫 번째 아미노산 메티오닌을 나타내고 *는 번역 종료를 나타낸다.위치 5에 있는 이소류신의 돌연변이 19개는 모두 아래와 같다.
무작위 돌연변이 유발 샘플 시퀀스 공간에 의해 생성된 DNA 라이브러리.주어진 위치에 치환된 아미노산이 표시된다.연결된 각 점 또는 점 세트는 라이브러리의 한 구성원입니다.오류가 발생하기 쉬운 PCR은 일부 잔류물을 다른 아미노산으로 무작위로 변이시킨다.알라닌 스캔은 단백질의 각 잔류물을 알라닌으로 하나씩 대체한다.부위 포화도는 20개의 가능한 아미노산(또는 일부 아미노산)을 하나씩 단일 위치에서 치환합니다.

분자생물학에서 라이브러리는 분자 복제 과정을 통해 미생물의 집단에 저장되고 전파되는 DNA 조각들의 집합이다.cDNA 라이브러리(역전사된 RNA에서 형성됨), 게놈 라이브러리(게놈 DNA에서 형성됨), 무작위 돌연변이 라이브러리(대체 뉴클레오티드 또는 코돈이 통합되는 de novo 유전자 합성에 의해 형성됨)를 포함한 다양한 유형의 DNA 라이브러리가 있습니다.DNA 라이브러리 기술은 현재 분자생물학, 유전공학, 단백질 공학의 주축이며, 이러한 라이브러리의 적용은 원본 DNA 조각의 출처에 달려 있습니다.라이브러리 준비에 사용되는 복제 벡터와 기술에 차이가 있지만, 일반적으로 각 DNA 조각은 복제 벡터에 독특하게 삽입되고 재조합 DNA 분자의 풀은 박테리아 집단(세균 인공 염색체 또는 BAC 라이브러리) 또는 효모로 옮겨집니다.s 평균 1개의 구성(표준 + 삽입)유기체의 인구가 배양에서 성장함에 따라, 유기체 안에 포함된 DNA 분자는 복제되고 전파된다(따라서, "복제"된다.

용어.

"도서관"이라는 용어는 각각 복제 벡터에 삽입된 DNA 분자를 운반하는 유기체의 집단을 가리킬 수도 있고, 또는 모든 복제 벡터 분자의 수집을 가리킬 수도 있습니다.

cDNA 라이브러리

주요 기사: cDNA 라이브러리

cDNA 라이브러리는 특정 소스(세포 집합, 특정 조직 또는 전체 유기체)에서 정제된 mRNA 샘플을 나타내며, 이는 역전사효소의 사용에 의해 DNA 템플릿으로 다시 변환된다.따라서 그것은 mRNA가 정제되었을 때 존재했던 생리적, 발달적, 환경적 조건 하에서 그 특정 소스에서 활발하게 전사되고 있던 유전자를 나타냅니다. cDNA 라이브러리는 "전장" 클론을 촉진하는 기술 또는 짧은 단편을 생성하는 조건에서 생성될 수 있습니다."시퀀스 태그"의 식별.

cDNA 라이브러리는 역유전학에서 유용하지만, 특정 유기체의 전체 게놈에서 매우 작은 부분(1% 미만)만을 차지한다.

cDNA 라이브러리의 응용 프로그램에는 다음이 포함됩니다.

  • 새로운 유전자의 발견
  • 유전자 기능 시험관내 연구를 위한 전장 cDNA 분자 복제
  • 다른 세포나 조직에서 발현되는 mRNA의 레퍼토리에 대한 연구
  • 다양한 세포 또는 조직의 대체 스플라이싱 연구

게놈 라이브러리

주요 기사: 게놈 라이브러리

게놈 라이브러리는 주어진 유기체의 전체 게놈을 함께 나타내는 복제품 세트입니다.게놈 라이브러리를 구성하는 클론의 수는 (1) 해당 게놈의 크기와 (2) 특정 클로닝 벡터 시스템이 허용하는 삽입 크기에 따라 달라집니다.대부분의 실용적인 목적을 위해, 유전체 DNA의 조직 소스는 중요하지 않다. 왜냐하면 신체의 각 세포는 사실상 동일한 DNA를 가지고 있기 때문이다.

Applications of genomic libraries include:

Synthetic mutant libraries

Depiction of one common way to clone a site-directed mutagenesis library (i.e., using degenerate oligos). The gene of interest is PCRed with oligos that contain a region that is perfectly complementary to the template (blue), and one that differs from the template by one or more nucleotides (red). Many such primers containing degeneracy in the non-complementary region are pooled into the same PCR, resulting in many different PCR products with different mutations in that region (individual mutants shown with different colors below).

In contrast to the library types described above, a variety of artificial methods exist for making libraries of variant genes.[1] Variation throughout the gene can be introduced randomly by either error-prone PCR,[2] DNA shuffling to recombine parts of similar genes together,[3] or transposon-based methods to introduce indels.[4] Alternatively, mutations can be targeted to specific codons during de novo synthesis or saturation mutagenesis to construct one or more point mutants of a gene in a controlled way.[5] This results in a mixture of double stranded DNA molecules which represent variants of the original gene.

The expressed proteins from these libraries can then be screened for variants which exhibit favorable properties (e.g. stability, binding affinity or enzyme activity). This can be repeated in cycles of creating gene variants and screening the expression products in a directed evolution process.[1]

Overview of cDNA library preparation techniques

DNA Extraction

If creating an mRNA library (i.e. with cDNA clones), there are several possible protocols for isolating full length mRNA. To extract DNA for genomic DNA (also known as gDNA) libraries, a DNA mini-prep may be useful.

삽입물 준비

cDNA 라이브러리는 mRNA의 전체 길이 클론이 (나중에 벡터에 삽입될) cDNA로 캡처되도록 주의를 요합니다.이러한 이유로 첫 번째 cDNA 가닥과 두 번째 cDNA 가닥의 합성을 최적화하고 벡터로 방향 복제를 더 쉽게 하도록 여러 프로토콜이 설계되었다.

추출된 gDNA에서 비특이적인 빈번한 커터 제한 효소를 이용하여 gDNA 단편을 생성한다.

벡터

관심 있는 뉴클레오티드 배열은 박테리아 세포를 감염시키기 위해 사용된 박테리오파지의 플라스미드 또는 게놈에 삽입물로 보존됩니다.

벡터는 박테리아 세포에서 가장 흔하게 번식하지만, 만약 YAC를 사용한다면 효모세포가 사용될 수 있다.벡터는 바이러스에서도 전파될 수 있지만 시간이 많이 걸리고 지루할 수 있습니다.그러나 바이러스(종종 페이징)를 사용하여 얻은 높은 전달 효율은 벡터(결합 삽입물)를 포장한 후 박테리아(또는 효모) 세포에 도입하는 데 유용합니다.

또한 cDNA 라이브러리의 경우, Lambda Zap II 파지, ExAssist 및 2개의 대장균 종을 사용하는 시스템이 개발되었습니다.loxP 부위를 이용한 Cre-Lox 시스템 및 재조합효소 생체내 발현을 대신 사용할 수도 있다.이것들은 생체내 절제 시스템의 예시이다.체외절제술은 종종 전통적인 제한 효소와 복제 전략을 사용하는 서브클로닝을 포함한다.체외 절제술은 체내 절제술 시스템보다 시간이 더 많이 소요될 수 있으며 더 많은 "핸드 온" 작업이 필요할 수 있습니다.어느 경우든 시스템은 벡터가 파지에서 라이브 셀로 이동하도록 허용하고, 라이브러리가 사용될 때까지 벡터가 복제 및 전파될 수 있습니다.

라이브러리 사용

관심 화학 물질을 생성하는 세포를 식별하기 위해 합성 라이브러리를 선별하기 위한 워크플로우.

여기에는 관심 시퀀스에 대한 "스크리닝"이 포함됩니다.이를 실현하는 방법은 여러 가지가 있습니다.

레퍼런스

  1. ^ a b Wajapeyee, Narendra; Liu, Alex Y.; Forloni, Matteo (2018-03-01). "Random Mutagenesis Using Error-Prone DNA Polymerases". Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3): pdb.prot097741. doi:10.1101/pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.
  2. ^ McCullum, Elizabeth O.; Williams, Berea A. R.; Zhang, Jinglei; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), "Random Mutagenesis by Error-Prone PCR", In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, Humana Press, vol. 634, pp. 103–109, doi:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978
  3. ^ Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (January 1998). "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution". Nature. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998Natur.391..288C. doi:10.1038/34663. PMID 9440693. S2CID 4352696.
  4. ^ Jones DD (May 2005). "Triplet nucleotide removal at random positions in a target gene: the tolerance of TEM-1 beta-lactamase to an amino acid deletion". Nucleic Acids Research. 33 (9): e80. doi:10.1093/nar/gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.
  5. ^ Wang, Tian-Wen; Zhu, Hu; Ma, Xing-Yuan; Zhang, Ting; Ma, Yu-Shu; Wei, Dong-Zhi (2006-09-01). "Mutant library construction in directed molecular evolution". Molecular Biotechnology. 34 (1): 55–68. doi:10.1385/MB:34:1:55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572. S2CID 44393645.

외부 링크

라이브러리 리소스 정보
유전자 라이브러리