포화 돌연변이 유발

Saturation mutagenesis
이론적 10-레시듀 단백질에서 단일 위치의 포화 돌연변이 유발.단백질의 야생형 버전은 상단에 나타나며, M은 최초의 아미노산 메티오닌을, *는 번역의 종료를 나타낸다.위치 5에 있는 돌연변이 19개는 모두 아래와 같다.

현장 포화 돌연변이 유발(SSM) 또는 단순히 현장 포화상태는 단백질 공학에서 사용되는 무작위 돌연변이 유발 기법으로, 단일 코돈 또는 코돈 세트가 그 위치에서 가능한 모든 아미노산으로 대체된다.[1]현장 포화 기법에는 쌍체 현장 포화(도서관의 모든 돌연변이에서 두 위치를 포화)부터 스캐닝 사이트 포화(단백질 내의 모든 현장에서 현장 포화를 수행하여 가능한 모든 지점 돌연변이를 포함하는 [20 x (단백질 내 잔류물 수)] 크기의 라이브러리를 생성함)에 이르기까지 많은 변형들이 있다.f. 단백질.

방법

사이트 지향 돌연변이 유발 라이브러리(즉, 퇴보된 올리고 사용)를 복제하는 하나의 일반적인 방법 묘사.관심 유전자는 템플릿(파란색), 하나 이상의 뉴클레오티드(빨간색)에 의해 템플릿과 다른 영역을 포함하는 올리고로 PCR로 처리된다.비완성 지역에서 퇴화성을 포함하는 그러한 프라이머는 동일한 PCR로 풀링되어 해당 지역에서 서로 다른 돌연변이를 가진 많은 다른 PCR 제품(아래에 다른 색을 가진 개별 돌연변이)이 발생한다.

포화 돌연변이 유발은 일반적으로 프리머(예: SeSaM)[2]에서 무작위화된 코돈으로 현장 유도 돌연변이 유발 PCR 또는 인공 유전자 합성에 의해 달성되며, 코돈에서 사용되는 합성 뉴클레오티드의 혼합물은 무작위화된다.[3]

다른 퇴화된 코돈은 아미노산 세트의 인코딩에 사용될 수 있다.[1]일부 아미노산은 다른 아미노산보다 많은 코돈에 의해 암호화되기 때문에 아미노산의 정확한 비율은 같을 수 없다.또한 정지 코돈(일반적으로 원하지 않는)을 최소화하는 퇴화된 코돈(codon)을 사용하는 것이 일반적이다.따라서 완전히 무작위화된 'NNN'은 이상적이지 않으며, 대안으로 더 제한적인 퇴행성 코돈(codon)이 사용된다.'NNK'와 'NNS'는 20개의 아미노산을 모두 인코딩하는 장점이 있지만, 여전히 3%의 시간 동안 정지 코돈을 인코딩한다.'NDT', 'DBK'와 같은 대체 코돈은 코돈의 사용을 완전히 피하며, 여전히 모든 주요 생물물리학적 유형(양극성, 계양성 소수성, 방향족 소수성, 소수성, 작은 것)을 포괄하는 최소한의 아미노산 세트를 암호화한다.[1]단 하나의 퇴화 코돈만을 사용할 수 있는 제한이 없는 경우에는 편향을 상당히 줄일 수 있다.[4][5]퇴화된 코돈과 그에 상응하는 아미노산을 높은 수준으로 제어할 수 있도록 몇 가지 계산 도구가 개발되었다.[6][7][8]

퇴화 코돈 코돈 수 아미노산수 정차 번호 암호화된 아미노산
NNN 64 20 3 모두 20
NNK / NNS 32 20 1 모두 20
NDT 12 12 0 RNDCGHILFSYV
DBK 18 12 0 아크길름프스트위브
NRT 8 8 0 RNDCGHSY

적용들

포화 돌연변이 유발은 일반적으로 방향 진화를 위한 변형을 생성하는데 사용된다.[9][10]

참고 항목

참조

  1. ^ a b c Reetz, M. T.; Carballeira J. D. (2007). "Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes". Nature Protocols. 2 (4): 891–903. doi:10.1038/nprot.2007.72. PMID 17446890. S2CID 37361631.
  2. ^ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (2004-07-15). "An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol". Nucleic Acids Research. 32 (14): e115. doi:10.1093/nar/gnh110. ISSN 0305-1048. PMC 514394. PMID 15304544.
  3. ^ Reetz, Manfred T.; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D.; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (2010-07-07). "Iterative Saturation Mutagenesis Accelerates Laboratory Evolution of Enzyme Stereoselectivity: Rigorous Comparison with Traditional Methods". Journal of the American Chemical Society. 132 (26): 9144–9152. doi:10.1021/ja1030479. ISSN 0002-7863. PMID 20536132.
  4. ^ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G.; Parra, Loreto P.; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J.; Reetz, Manfred T.; Acevedo, Juan Pablo (2013-02-15). "Reducing Codon Redundancy and Screening Effort of Combinatorial Protein Libraries Created by Saturation Mutagenesis". ACS Synthetic Biology. 2 (2): 83–92. doi:10.1021/sb300037w. PMID 23656371.
  5. ^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (June 2014). "MDC-Analyzer: a novel degenerate primer design tool for the construction of intelligent mutagenesis libraries with contiguous sites". BioTechniques. 56 (6): 301–302, 304, 306–308, passim. doi:10.2144/000114177. ISSN 1940-9818. PMID 24924390.
  6. ^ Halweg-Edwards, Andrea L.; Pines, Gur; Winkler, James D.; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (September 16, 2016). "A Web Interface for Codon Compression". ACS Synthetic Biology. 5 (9): 1021–1023. doi:10.1021/acssynbio.6b00026. ISSN 2161-5063. PMID 27169595.
  7. ^ Engqvist, Martin K. M.; Nielsen, Jens (2015-04-30). "ANT: Software for Generating and Evaluating Degenerate Codons for Natural and Expanded Genetic Codes". ACS Synthetic Biology. 4 (8): 935–938. doi:10.1021/acssynbio.5b00018. PMID 25901796.
  8. ^ Kell, Douglas B.; Day, Philip J.; Breitling, Rainer; Green, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (2017-07-10). "CodonGenie: optimised ambiguous codon design tools". PeerJ Computer Science. 3: e120. doi:10.7717/peerj-cs.120. ISSN 2376-5992.
  9. ^ Chica, Robert A.; et al. (2005). "Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution and rational design". Current Opinion in Biotechnology. 16 (4): 378–384. doi:10.1016/j.copbio.2005.06.004. PMID 15994074.
  10. ^ Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (2009-02-01). "Advances in generating functional diversity for directed protein evolution". Current Opinion in Chemical Biology. Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry. 13 (1): 19–25. doi:10.1016/j.cbpa.2009.01.019. PMID 19261539.