세포주기분석

Cell cycle analysis

DNA 함량 측정에 의한 세포 주기 분석은 세포 주기의 다른 단계에서 세포를 구별하기 위해 유동 세포계를 가장 많이 사용하는 방법이다.분석 전 세포는 보통 투과되어 요오드화 프로피듐(PI)이나 4,6-다이아미디노-2-페닐린돌(DAPI)과 같이 DNA를 정량적으로 얼룩지게 하는 형광염료로 처리된다.착색된 세포의 형광 강도는 그들이 함유하고 있는 DNA의 양과 관련이 있다.S상 동안 DNA 함량이 두 배로 증가함에 따라, G상0 및 G상1(S 이전), G상2 및 M상(S 이후)에서 세포의 DNA 함량(그리고 그에 따른 형광 강도)은 세포 주기의 주요상(G0/G1 대 S 대 G2/M 위상)에서 세포 주기 위상 위치를 식별한다.개별 세포의 세포 DNA 함량은 종종 세포 주기의 주요 단계에서 세포의 상대적 주파수(백분율)에 대한 정보를 제공하기 위해 주파수 히스토그램으로 표시된다.null

DNA 함량 주파수 히스토그램에 나타난 세포 주기 이상은 다른 유형의 세포 손상 후에 종종 관찰된다. 예를 들어, 특정 검사점에서 세포 주기 진행을 방해하는 DNA 손상과 같은 것이다.그러한 세포 주기 진행의 구속은 효과적인 DNA 회복으로 이어질 수 있는데, 이것은 암세포로 정상의 변형을 막을 수도 있고(카시노제네시스) 세포사멸로 이어질 수도 있으며, 종종 세포사멸의 모드에 의해서 말이다.G나0 G에서1 세포를 체포하는 것은 예를 들어 혈청 결핍 후 영양소(성장 요인) 부족의 결과로 보여지는 경우가 많다.세포 주기 분석은 1969년 캘리포니아 대학교의 한 그룹이 Feulgen staining 기법을 사용하여 로스 알라모스 과학 실험실에서 처음 설명하였다.[1]요오드화 프로피듐 얼룩을 이용한 세포주기 분석을 위한 첫 번째 프로토콜은 1975년 하버드 의과대학의 아우타르 크리슈안에 의해 제시되었으며 오늘날에도 여전히 널리 인용되고 있다.[2]null

세포 주기의 다중 파라미터 분석에는 세포 DNA 함량 측정 외에도 다른 세포 주기와 관련된 성분/특성이 포함된다.세포 DNA와 RNA 함량을 동시에 측정하거나, 메타크롬 염료 아세리딘 오렌지를 사용하여 낮은 pH에서 변성할 수 있는 DNA 감수성을 측정하면1Q G, G1A, G 세포1B 주기 구획이 드러나며, S, G2, 유사 세포를 구별할 수 있다.[3]G의1Q 세포는 대기상태로 세포 주기(G로도0 확인 가능), G는1A 성장단계에 있는 반면 G는1B S로 진입하기 직전에 세포로서 DNA 복제를 시작하는 세포와 유사한 성장(RNA와 단백질 함량, 크기)을 갖는다.유사한 세포 주기 칸 또한cyclin D1,cyclin E를 표현한 측정을 포함한다multiparameter 분석에 의해, A와cyclin B1, 각 DNA콘텐츠에 관계[4]DNA콘텐츠Concurrent 측정과 DNA전구체의 설립 흘림 세포 계측 법에 의해 5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)의에는 usefu cyclin 인정을 받고 있습니다.l측정은 체외 및 체내 세포 주기 분석에 널리 사용되어 왔다.[5]그러나 BrdU에 비해 검출이 일정한 장점을 제공하는 전구체인 5-ethyl-2'-deoxyuridine(EDU)의 결합은 이제 DNA 복제(S-phase) 세포를 검출하는 데 있어 선호되는 방법론이 되었다.[6]null

실험절차

DAPI(마그네타)는 DNA(녹색과 청색)의 작은 홈에 묶여 있다.PDB: 1D30.

Hoechst 33342를 사용하여 얼룩을 수행하지 않는 한, 세포 주기 분석을 위한 세포 준비의 첫 번째 단계는 세포 플라즈마 막의 투과성이다.이것은 보통 그것들을 트리톤 X-100이나 NP-40과 같은 순한 세제를[7] 함유한 완충 용액에 배양하거나 에탄올에 고정시키는 방법으로 이루어진다.대부분의 형광 DNA 염료(예외 중 하나는 Hoechst 33342)는 플라즈마 막 투과물이 아니며, 즉, 온전한 세포막을 통과할 수 없다.그러므로 투과 안정화는 다음 단계인 세포의 얼룩을 성공시키기 위해 중요하다.null

(또는 얼룩 단계 이전) 세포는 종종 RNA를 제거하기 위해 RNase A로 처리된다.이것은 DNA를 얼룩지게 하는 특정 염료도 RNA를 얼룩지게 하여 결과를 왜곡시키는 아르테팩트를 생성하기 때문에 중요하다.예외는 메타크롬 형광색소 아세리딘 오렌지로, 특정 얼룩 프로토콜에 따라 RNA와 부분 DNA 변성 후 RNA와 DNA 둘 다 미분하게 얼룩질 수 있으며, RNA와 부분 DNA 변성 후 다른 프로토콜에서 이중 변형 DNA(녹색 형광) 대 미분하게 얼룩질 수 있다.단일 가닥 DNA([3]빨간 발광).요오드화 프로피듐과 아세리딘 오렌지 외에 자주 사용되는 계량 가능한 염료에는 DRAQ5, 7-아미노액티노마이신 D, DAPI 및 회흐스트 33342가 포함된다.null

더블트 차별

세포와 특히 고정된 세포가 서로 붙는 경향이 있기 때문에, 세포 골재는 더블트 차별이라는 과정을 통해 분석에서 제외되어야 한다.이것은 두 개의0 G/G1 세포의 더블트가 DNA의 총 함량이 동일하고 따라서 단일 G2/M 세포와 동일한 형광 강도를 가지기 때문에 중요하다.[8][9]그러한0 G/G1 복선으로 인식되지 않는 한, G2/M 셀의 잘못된 양성 식별 및 개수에 기여할 수 있다.null

관련 방법

니코레티 검사

니콜레티 분석은 발명가인 이탈리아 의사 일도 니콜레티의 이름을 딴 것으로 세포 주기 분석의 변형된 형태다.DNA 함량이 2n("sub-G0/G1 cell") 미만인 세포를 분석하여 프로그램된 세포 사멸의 한 형태인 세포사멸을 검출하고 정량화하는 데 사용된다.그러한 세포는 대개 세포핵 분열의 결과물이다: 세포핵 분열 동안, DNA는 세포 내핵에 의해 분해된다.따라서 세포핵은 건강한 G0/G1 세포의 핵보다 DNA가 적게 들어 있어, 표본 내 세포의 상대적 양을 결정하는 데 사용할 수 있는 형광 히스토그램에서 G/G1 미만의0 피크가 발생한다.이 방법은 니코레티와 페루자 의과대학 동료들에 의해 1991년에 처음 개발되어 기술되었다.[10]원본 출판물 중 두 명의 저자에 의해 개발된 최적화된 프로토콜이 2006년에 출판되었다.[11]모든0 확률에서 DNA 함량이 GG01 피크 5% 미만인 서브 G/G1 피크 내에서 측정한 물체는 세포핵체이므로 개별 세포는 나타내지 않는다.

건강한(왼쪽) 세포와 사선(중, 오른쪽) 세포가 있는 니코렛티 검사

  • 건강한 세포.서브0 G/G1 피크가 없다는 점에 유의하십시오.null

  • 세포사멸 유도 후 하루 만에 세포사멸서브0 G/G1 피크가 있는지 확인하십시오.null

  • 세포사멸 유도 후 며칠 후에 세포사멸.서브0 G/G1 피크의 상대적 증가를 참고하십시오.null

참조

  1. ^ Van Dilla MA, Trujillo TT, Mullaney PF, Coulter JR (14 March 1969). "Cell Microfluorometry: A Method for Rapid Fluorescence Measurement". Science. 163 (3872): 1213–1214. Bibcode:1969Sci...163.1213V. doi:10.1126/science.163.3872.1213. PMID 5812751.
  2. ^ Krishan A. (July 1975). "Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining". The Journal of Cell Biology. 66 (1): 188–193. doi:10.1083/jcb.66.1.188. PMC 2109516. PMID 49354.
  3. ^ Darzynkiewicz Z, Traganos F, Melamed MR (1980). "New cell cycle compartments identified by multiparameter flow cytometry". Cytometry. 1 (2): 98–108. doi:10.1002/cyto.990010203. PMID 6170495.
  4. ^ Darzynkiewicz Z, Gong JP, Juan G, Ardelt B, Traganos F (1996). "Cytometry of cyclin proteins". Cytometry. 25 (1): 1–13. doi:10.1002/(SICI)1097-0320(19960901)25:1<1::AID-CYTO1>3.0.CO;2-N. PMID 8875049.
  5. ^ Gray JW, Dolbeare F, Pallavicini MG, Beisker W, Waldman F (1986). "Cell cycle analysis using flow cytometry". Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 49 (2): 237–55. doi:10.1080/09553008514552531. PMID 3510993.
  6. ^ Buck SB, Bradford J, Gee KR, Agnew BJ, Clarke ST, Salic A (2008). "Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies". BioTechniques. 44 (7): 927–9. doi:10.2144/000112812. PMID 18533904.
  7. ^ Vindeløv LL, Christensen IJ, Nissen NI (March 1983). "A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis". Cytometry. 3 (5): 323–327. doi:10.1002/cyto.990030503. PMID 6188586.
  8. ^ Sharpless T, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Melamed MR (1975). "Flow cytofluorimetry: discrimination between single cells and cell aggregates by direct size measurements". Acta Cytol. 19 (6): 577–81. PMID 1108568.
  9. ^ Wersto RP, Chrest FJ, Leary JF, Morris C, Stetler-Stevenson MA, Gabrielson E (15 October 2001). "Doublet discrimination in DNA cell-cycle analysis". Cytometry. 46 (5): 296–306. doi:10.1002/cyto.1171. PMID 11746105.
  10. ^ Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3 June 1991). "A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry". Journal of Immunological Methods. 139 (2): 271–279. doi:10.1016/0022-1759(91)90198-O. PMID 1710634.
  11. ^ Riccardi C, Nicoletti I (9 November 2006). "Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry". Nature Protocols. 1 (3): 1458–1461. doi:10.1038/nprot.2006.238. PMID 17406435.
  12. ^ Darzynkiewicz Z, Bedner E, Traganos F (2001). "Difficulties and pitfalls in analysis of apoptosis". Methods Cell Biol. 63: 527–559. doi:10.1016/s0091-679x(01)63028-0. PMID 11060857.

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