프라이머 이합체

Primer dimer

프라이머 이합체(PD)는 일반적인 생명공학 방법인 중합효소 연쇄반응(PCR)의 잠재적 부산물이다.이름에서 알 수 있듯이, PD는 프라이머에 있는 상보적인 염기의 끈 때문에 서로 결합(하이브리드)된 두 개의 프라이머 분자로 구성됩니다.그 결과, DNA 중합효소는 PD를 증폭시켜 PCR 시약의 경쟁을 초래하고, PCR 증폭을 목표로 하는 DNA 배열의 증폭을 잠재적으로 억제한다.정량적 PCR에서 PD는 정확한 정량화를 방해할 수 있습니다.

형성 메커니즘

mechanism of primer dimer formation and amplification
프라이머 다이머는 3단계 프로세스로 형성 및 증폭됩니다.

프라이머 다이머를 3단계로 형성하여 증폭한다.제1공정에서는 각각 3'의 끝에서 2개의 프라이머를 소둔한다(그림의 스텝 I).이 구조가 충분히 안정적이면 DNA 중합효소는 상보적 배열에 따라 프라이머를 결합하고 확장합니다(그림의 단계 II).스텝 I에서 구조물의 안정성에 기여하는 중요한 요인은 오버랩의 3' 끝과 길이에서 높은 GC 함량이다.세 번째 단계는 다음 사이클에서 발생하며, 2단계 제품의 단일 가닥을 템플릿으로 사용하여 신선한 프라이머를 제거하여 더 많은 PD [1]제품을 합성합니다.

검출

프라이머 이합체는 PCR 제품의 겔 전기영동 후에 보일 수 있습니다.브롬화 에티듐 오염 겔의 PD는 보통 30-50 염기쌍(bp) 밴드 또는 중간에서 높은 강도의 스미어로 나타나며, 일반적으로 50bp보다 긴 표적 배열의 대역과 구별할 수 있다.

양적 PCR에서는 이중사슬 DNA 검출용 비특이성 염료인 SYBR Green I 등의 중간 염료에 의한 용융곡선 분석에 의해 PD를 검출할 수 있다.PD는 보통 짧은 시퀀스로 구성되기 때문에 목표 시퀀스보다 낮은 온도에서 변성되므로 용해 곡선의 특성으로 구분할 수 있습니다.

프라이머-다이머 형성 방지

PD를 방지하기 위한 한 가지 접근법은 PCR 시스템의 물리적 화학적 최적화, 즉 프라이머, 염화 마그네슘, 뉴클레오티드, 이온 강도 및 반응 온도를 변경하는 것이다.이 방법은 PCR에서 표적 시퀀스의 증폭 효율을 결정하는 물리적 화학적 특성에 의해 다소 제한된다.따라서 PD 형성을 감소시키면 PCR 효율이 저하될 수 있습니다.이러한 한계를 극복하기 위해, 다른 방법들은 프라이머 설계와 다른 PCR 효소 시스템 또는 [citation needed]시약의 사용을 포함하여 PD의 형성을 줄이는 것을 목표로 한다.

프라이머 설계 소프트웨어

프라이머 설계 소프트웨어는 DNA 2차 구조 형성과 프라이머 쌍에 대한 프라이머의 아닐 가능성을 확인하는 알고리즘을 사용합니다.소프트웨어에 의해 고려되는 물리적 파라미터는 프라이머의 잠재적 자기충족성 및 GC함유량, 프라이머의 용융온도 유사, DNA 타깃 [2]시퀀스에 스템루프 등의 2차구조가 없는 경우입니다.

핫 스타트 PCR

주요 기사:핫 스타트 PCR

프라이머는 서로 상호보완성이 낮도록 설계되어 있기 때문에 반응 혼합물을 준비하는 동안과 같이 낮은 온도(예: 상온)에서만 소둔될 수 있습니다(그림의 1단계).PCR에 사용되는 DNA 중합효소는 약 70°C에서 가장 활성화되지만 낮은 온도에서도 일부 중합 활성이 있어 서로 [3]어닐링한 후 프라이머에서 DNA 합성을 일으킬 수 있습니다.반응이 작동 온도(60-70°C)에 도달할 때까지 PD 형성을 방지하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었으며, 여기에는 DNA 중합효소의 초기 억제 또는 반응 혼합물이 더 높은 온도에 도달할 때까지 반응 성분 반응을 물리적으로 분리하는 것이 포함된다.이러한 방식을 핫 스타트 PCR이라고 부릅니다.

왁스: 이 방법에서는 반응이 [4]고온에 이르면 녹는 왁스에 의해 효소가 반응 혼합물에서 공간적으로 분리된다.

마그네슘의 느린 방출: DNA 중합효소에는 마그네슘 이온이 [5]필요하므로 마그네슘은 화학적으로 화합물에 결합하여 반응으로부터 분리되며 고온에서만 용액에 방출됩니다.

억제제의 비공유 결합: 본 방법에서는 펩타이드, 항체[7] 또는 압타머가[8] 저온에서 효소에 비공유 결합되어 활성을 저해한다.95 °C에서 1~5분간 배양한 후 억제제가 방출되고 반응이 시작된다.

냉감성 Taq 중합효소: 저온에서 거의 [9]활성이 없는 변형된 DNA 중합효소입니다.

화학적 수식: 본 방법에서는 DNA 중합효소 활성부위의 아미노산 측쇄에 작은 분자가 공유결합되어 있다.이 작은 분자는 95 °C에서 10 ~ 15분 동안 반응 혼합물을 배양하여 효소로부터 방출된다.일단 작은 분자가 방출되면 [10]효소는 활성화된다.

프라이머의 구조 변경

PD 형성을 방지하거나 줄이는 또 다른 방법은 자신 또는 서로 어닐링이 확장을 일으키지 않도록 프라이머를 수정하는 것입니다.

HANDS(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System[11]): 프라이머의 3' 말단을 보완하는 뉴클레오티드 꼬리를 프라이머의 5' 말단에 첨가한다.5' 꼬리가 가까이 있기 때문에 프라이머의 3' 끝부분까지 소둔됩니다.그 결과 스템 루프 프라이머는 짧은 오버랩을 수반하는 어닐링을 배제하지만 프라이머를 타깃의 완전한 보완 시퀀스로 어닐링할 수 있다.

키메라 프라이머: 프라이머의 일부 DNA 염기가 RNA 염기로 대체되어 키메라 서열을 만듭니다.다른 키메라 서열을 가진 키메라 서열의 용해 온도는 DNA를 가진 키메라 서열을 가진 키메라 서열의 용해 온도보다 낮습니다.이 차이를 통해 프라이머가 다른 키메라 [12]프라이머에는 아닐하지만 타깃 시퀀스에 대해서는 아닐하도록 아닐링 온도를 설정할 수 있습니다.

블록 제거 프라이머: RNase H 의존 PCR(RHPCR)[13]로 알려진 방법은 고온에서 PCR 프라이머에서 블로킹 그룹을 제거하기 위해 내열성 RNase HII를 사용합니다.이 RNase HII 효소는 저온에서 거의 활성을 보이지 않으므로 블록 제거는 고온에서만 이루어집니다.또한 효소는 고유한 프라이머:템플릿 불일치 판별 기능을 가지고 있어 프라이머-다이머에 대한 추가 선택이 가능합니다.

자가 회피 분자 인식 시스템 : [14]SAMRS라고도 하며, 프라이머에 뉴클레오티드 유사체 T*, A*, G* 및 C*를 도입하여 프라이머 이합체를 제거합니다.SAMRS DNA는 자연 DNA와 결합할 수 있지만 동일한 SAMRS 종의 다른 구성원에게는 결합할 수 없습니다.예를 들어 T*는 A에는 바인드 할 수 있지만 A*에는 바인드 할 수 없습니다.A*는 T에는 바인드 할 수 없습니다.따라서 [15]신중한 설계를 통해 SAMRS의 프라이머 구축은 프라이머-프라이머 상호작용을 피하고 민감한 SNP 검출은 물론 다중 PCR을 가능하게 할 수 있다.

프라이머 다이머로부터의 신호 수집 방지

위의 방법들은 PD 형성을 줄이도록 설계되었지만, 또 다른 방법은 정량적 PCR에서 PD에서 생성되는 신호를 최소화하는 것을 목표로 합니다.이 방법은 PD가 거의 형성되지 않고 제품 축적에 대한 억제 효과가 경미한 한 유용합니다.

4단계 PCR: SYBR Green I과 같은 비특이성 염료 작업 시 사용됩니다.PD의 길이와 타깃 시퀀스의 용해온도가 다르다는 점에 기초하고 있습니다.이 방법에서는 신호가 대상 시퀀스의 용해 온도보다 낮지만 PD의 [16]용해 온도보다 높습니다.

시퀀스 고유의 프로브:TaqMan 및 분자 비콘 프로브는 대상(보완적) 시퀀스가 존재하는 경우에만 신호를 생성하며, 이 향상된 특이성은 PD로부터의 신호 수집(제품 축적에 대한 가능한 억제 효과)을 방지합니다.

레퍼런스

  1. ^ Alberts; et al. (2017). Molecular Biology of the Cell (6th ed.). Garland Science. pp. 708–711.
  2. ^ 레이든 대학 의료원의 프라이머 디자인 페이지
  3. ^ Patel, Ewing (2008). Polymerase Chain Reaction: Techniques and Applications. Scientific Press. pp. 595–599.
  4. ^ Chou, Quin; Russell, Marion; Birch, David E.; Raymond, Jonathan; Bloch, Will (1992). "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications". Nucleic Acids Research. 20 (7): 1717–23. doi:10.1093/nar/20.7.1717. PMC 312262. PMID 1579465.
  5. ^ Yang, Linjing; Arora, Karunesh; Beard, William A.; Wilson, Samuel H.; Schlick, Tamar (2004). "Critical role of magnesium ions in DNA polymerase beta's closing and active site assembly". Journal of the American Chemical Society. 126 (27): 8441–53. doi:10.1021/ja049412o. PMID 15238001.
  6. ^ 미국 특허출원번호 2007/0254327
  7. ^ 미국 특허번호 5338671
  8. ^ 미국 특허번호 6183967
  9. ^ 미국 특허번호 6214557
  10. ^ 미국 특허번호 5677152
  11. ^ Brownie, Jannine; Shawcross, Susan; Theaker, Jane; Whitcombe, David; Ferrie, Richard; Newton, Clive; Little, Stephen (1997). "The elimination of primer-dimer accumulation in PCR". Nucleic Acids Research. 25 (16): 3235–41. doi:10.1093/nar/25.16.3235. PMC 146890. PMID 9241236.
  12. ^ "Chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions". Patent Lens.
  13. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA (August 2011). "RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers". BMC Biotechnology. 11: 80. doi:10.1186/1472-6750-11-80. PMC 3224242. PMID 21831278.
  14. ^ Hoshika S, Chen F, Leal NA, Benner SA (2020). "Artificial Generic Systems: Self-Avoiding ENA in PCR and Multiplexed PCR". Angew. Chem. 122 (32): 5686–5689. doi:10.1002/ange.201001977. PMC 6027612. PMID 20586087.
  15. ^ Yang ZY, Le JT, Hutter D, Bradley KM, Overton BR, McLendon C, Benner SA (2020). "Elimilating primer dimers and improving SNP detection using self-avoiding molecular recognition systems". Biology Methods and Protocols. 5 (1): bpaa004. doi:10.1093/biomethods/bpaa004. PMC 7200914. PMID 32395633.
  16. ^ 4단계 PCR

외부 링크

"Online software for primer dimer prediction". OligoAnalyzer 3.1. Integrated DNA Technologies.
"Primer design. What is the primer-dimer?". YouTube video. Archived from the original on 2021-12-20.