친수성 상호작용 크로마토그래피

Hydrophilic interaction chromatography
참고 항목: 크로마토그래피

친수성 상호작용 크로마토그래피(또는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, HILIC)는 정상상 액체 크로마토그래피의 변형으로, 이온 크로마토그래피와 역상 액체 크로마토그래피와 같은 다른 크로마토그래피 애플리케이션과 부분적으로 중복된다. HILIC는 역상 유형의 용융제와 함께 친수성 고정 단계를 사용한다. 이 이름은 앤드류 앨퍼트가 1990년 발표한 이 주제에 대한 논문에서 제안한 것이다.[1] 그는 이를 위한 크로마토그래픽 메커니즘을 분석물이 극성을 증가시키기 위해 용출되는 액체-액체-액체 파티션 크로마토그래피라고 설명했는데, 이는 발표된 데이터의 검토와 재평가에 의해 뒷받침되는 결론이다.[2]

HILIC 파티션 매개 변수 유용한 범위

표면

모든 극성 크로마토그래피 표면은 HILIC 분리에 사용할 수 있다. 심지어 극성이 아닌 접합 실리콘도 극도로 높은 유기 용매 성분으로 사용되었는데, 이때 크로마토그래픽 매체에 사용된 실리카는 특히 극성이었다. 이 예외를 제외하고 HILIC 단계는 중립 극지방 또는 이온 표면의 5가지 범주로 분류할 수 있다.

이동 위상

HILIC 크로마토그래피의 대표적인 이동 단계에는 소량의 물을 가진 아세토나이트릴("MCN"으로도 지정됨)이 포함된다. 단, 물과 혼동할 수 있는 모든 비독성 용매(예: THF 또는 다이옥산)를 사용할 수 있다. 알코올은 또한 사용될 수 있지만, 무화합 용제 - 물 조합에 상대적인 분석 물질에 대해 동일한 수준의 보존을 달성하려면 알코올 농도가 더 높아야 한다. 수성 정규 위상 크로마토그래피 참조

일반적으로 HILIC에서 이동 위상은 극지방 정지 위상 대 수적 결핍 이동 위상의 표면에 수분이 풍부한 층을 형성하여 액체/액체 추출 시스템을 만든다고 여겨진다. 분석 물질은 이 두 층 사이에 분포되어 있다. 그러나 HILIC는 단순한 파티셔닝 이상의 역할을 하며, 보존에 사용되는 높은 유기 용제 조건 하에서 약한 정전기 메커니즘뿐만 아니라 중성 극종 사이의 수소 기증자 상호작용을 포함한다. 이것은 HILIC를 이온 교환 크로마토그래피와 구별되는 메커니즘으로 구별한다. 더 많은 극성 화합물이 덜 극성 화합물보다 고정된 수성층과 더 강한 상호작용을 가질 것이다. 따라서 화합물의 극성과 용도의 분리가 일어난다.

첨가제

아세트산 암모늄과 포메이트 암모늄과 같은 이온 첨가물은 이동상 pH와 이온 강도를 제어하는 데 주로 사용된다. HILIC에서 그것들은 또한 분석 물질의 극성에 기여할 수 있으며, 그 결과 보존에 있어 다른 변화를 일으킬 수 있다. 극지 분석 물질(예: 아미노글리코사이드 항생제(젠타미닌) 또는 아데노신 트리인산염)의 경우 분석 물질이 단일 이온 형태로 존재하도록 보장하기 위해 고농도의 버퍼(ca. 100mM)가 필요하다. 그렇지 않으면 비대칭 피크 형상, 크로마토그래픽 테일링 및/또는 정지 단계로부터의 부실한 회복이 관찰될 것이다. 중성 극지 분석 물질(예: 탄수화물)의 분리에 대해서는 완충제가 필요하지 않다.

고유기성 용제 혼합물(ca. 70~90% 아세토나이트릴)에 용해되는 100~300mM 과염소산나트륨과 같은 다른 염분을 사용하여 용출에 영향을 미치는 이동상 극성을 높일 수 있다. 이 염들은 휘발성이 없기 때문에 이 기법은 질량 분광계를 검출기로 사용하면 덜 유용하다. 일반적으로 (증가하는 물의 양에 대한) 구배는 용출을 촉진하기에 충분하다.

모든 이온은 어느 정도 정지 위상으로 분할되므로 재현 가능한 정지 위상이 보장되도록 가끔씩 물로 "세척"해야 한다.

적용들

HILIC 분리 모드는 극성의 차이에 의해 일부 생체 분자, 유기 분자 및 일부 무기 분자의[4] 분리에 광범위하게 사용된다. 대사물 분석을 할 때 생물학적 샘플에 대한 샘플 준비의 간소화로 그 효용이 증가했는데, 이는 대사물 분석 과정에서 일반적으로 세포 조직에서 제거하기 위해 극지군이 추가되기 때문이다. 이 분리 기법은 또한 생물학적 의료 제품에서 글리코프로틴과 글리코폼의 글리코실화 분석[5] 및 품질 보증에도 특히 적합하다.[6] HILIC는 크로마토그래픽 검출기로 전기화이온화 질량 분광법을 사용하여 극성 화합물을 검출하기 위해 유기 용제가 훨씬 휘발성이 높기 때문에 역상 크로마토그래피에[4] 비해 감도가 10배 증가할 수 있다.

pH 선택

약하게 이온성이 있는 표면화학물질로 pH의 선택은 기둥 화학의 이온성에 영향을 미칠 수 있다. 적절하게 조정하면, pH는 기둥과 동일한 전하로 기능 그룹에 대한 선택성을 감소시키거나 반대로 충전된 기능 그룹에 대해 개선하도록 설정할 수 있다. 마찬가지로 pH의 선택은 용액의 극성에 영향을 미친다. 단, 이온성이 강하여 pH 척도의 중간 범위(pH 3.5-8.5)에서 pH 값에 대한 내성이 있는 기둥 표면 화학자의 경우 이러한 분리는 분석 물질의 극성만을 반영하므로 방법 개발을 수행할 때 더 쉽게 이해할 수 있다.

에를릭

2008년 앨퍼트는 HILIC 분리에 대해 분석 물질 또는[7] 분석 물질 집합 내에서 공통의 이온성 극성 그룹을 밀어내기 위해 이온성 기둥 표면 화학이 사용되는 ERLIC(정전기억제 친수성 상호작용 크로마토그래피)라는 용어를 만들어 나머지 극성 그룹에 의한 분리를 용이하게 했다. 정전기 효과는 중성 극지방 효과보다 화학적 잠재력이 훨씬 강하다. 이것은 분석 물질 분자의 집합 내에서 공통의 이온성 그룹의 영향을 최소화하거나, 어떤 상황에서는 기울기 대신 이소크라테스적인 분리를 가능하게 하면서 더 많은 극성 기능 그룹과의 유지 정도를 감소시킨다. 그의 후속 간행물은 다른 사람들이 또한 이온-페어 정상상[9] 또는 e-HILIC라고 부르는 방향 효과를[8] 더 자세히 설명했으며, 이는 매력적이거나 혐오스러운 분석 물질의 특정 이온 부분에 민감한 보존 메커니즘을 반영한다. ERLIC(eHILIC) 분리가 이소크라틱할 필요는 없지만, 순효과는 특히 강한 극성 집단의 끌어당김이 감소하여 강한 용출 조건이 덜 필요하며, 분석 물질의 나머지 극성(반극 충전 이온 또는 비이온성) 기능 집단의 상호작용이 강화되는 것이다.

큐티브 에힐릭

예를 들어 음이온(음전하) 그룹의 보유에 대한 영향을 줄이기 위해 ERLIC 분리에 양이온 교환(음전하) 표면 화학(뉴클레오티드 또는 포소폰 항생제 혼합물의 인산염 또는 변형 탄수화물의 시알산 그룹)을 사용하여 이제 기본에 기초한 분리를 더 많이 허용할 수 있다.d/또는 이러한 분자의 중립적 기능 그룹. 표면에서 약하게 이온 그룹(예: 카복실)의 극성을 수정하는 것은 pH를 해당 그룹의 pKa에서 두 pH 단위 이내로 조정함으로써 쉽게 달성된다. 표면의 강력한 이온 기능 그룹(즉, 황산염 또는 인산염)의 경우, 잔존 전하가 완전히 이온 쌍을 이루지 않도록 낮은 양의 완충제를 대신 사용할 수 있다. 그 예로는 12.5 mM (권장 >20 mM 버퍼 대신), 고분자, zwitterionic, 베타인-술폰산염 표면에 12.5 mM (각각 인산염 그룹을 포함)의 이동 단계를 사용하는 것이다. 이것은 약간 줄어든 (pH에 의해), 쿼터너리 아민에 대한 그것의 표면 화학에 대한 기둥의 설폰산 기능 그룹의 영향을 강화한다. 이에 비례하여, 이러한 분석 물질은 중성 극지방 HILIC 표면을 사용한 경우보다 더 많은 양의 유기 용매에서 용매의 보존이 감소하는 것을 보일 것이다. 이것은 또한 음이온 질량 분광법에 의한 검출 민감도를 증가시킨다.

애니오닉 에힐릭

위와 유사하게 음이온 교환(전하전하) 열 표면 화학물질을 사용하여 인산화 펩타이드 또는 황화 다당류 분자를 선택적으로 분리하는 경우와 같이 분석 물질 세트의 양이온(전하전하전하) 기능 그룹 보유에 미치는 영향을 줄일 수 있다. pH 1과 2 pH 사이에 pH를 사용하면 인산염 그룹의 이온화 가능한 옥시겐 3개 중 2개의 극성이 감소하므로 (반전하) 표면 화학으로부터 쉽게 탈착할 수 있다. 또한 이 낮은 pH 값으로 양성되기 때문에 분석 물질에서 음전하 카복시의 영향을 감소시키고, 따라서 분자에 대한 전체적인 극성을 감소시킬 것이다. 일반적으로 양극으로 충전된 아미노 그룹은 기둥 표면 화학에서 제거될 것이며 따라서 이러한 조건들은 분리 시 인산염 극성(다른 중성 극성 그룹뿐만 아니라)의 역할을 강화한다.

참조

  1. ^ Alpert, Andrew J. (1990). "Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds". Journal of Chromatography. 499: 177–196. doi:10.1016/S0021-9673(00)96972-3. PMID 2324207.
  2. ^ Petrus Hemström and Knut Irgum (2006). "Review: Hydrophilic Interaction Chromatography". J. Sep. Sci. 29 (12): 1784–1821. doi:10.1002/jssc.200600199. PMID 16970185.
  3. ^ Boguslaw Buszewski and Sylwia Noga (2012). "Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)—a powerful separation technique". Anal. Bioanal. Chem. 402 (1): 231–247. doi:10.1007/s00216-011-5308-5. PMC 3249561. PMID 21879300.
  4. ^ a b Eric S. Grumbach; et al. (October 2004). "Hydrophilic Interaction Chromatography Using Silica Columns for the Retention of Polar Analytes and Enhanced ESI-MS Sensitivity". LCGC Magazine. Archived from the original on 2007-08-06. Retrieved 2008-07-14.
  5. ^ Ahn, Joomi; Bones, Jonathan; Yu, Ying Qing; Rudd, Pauline M.; Gilar, Martin (2010-02-01). "Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using hydrophilic interaction chromatography columns packed with 1.7 μm sorbent". Journal of Chromatography B. 878 (3–4): 403–408. doi:10.1016/j.jchromb.2009.12.013. PMID 20036624.
  6. ^ 수문 상호작용 크로마토그래피(HILIC)에 의한 글리코실레이션 분석 - 뮤린 TGFR-3(Application Note TSOH Biosciics) ZP-영역의 N-Glyco 매핑. 2013년 5월 23일 검색됨
  7. ^ Alpert, Andrew J. (January 2008). "Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides". Anal. Chem. 80 (1): 62–76. doi:10.1021/ac070997p. PMID 18027909.
  8. ^ Alpert, Andrew J.; et al. (June 2010). "Peptide Orientation Affects Selectivity in Ion-Exchange Chromatography". Anal. Chem. 82 (12): 5253–5259. doi:10.1021/ac100651k. PMC 2884984. PMID 20481592.
  9. ^ Ding, W.; et al. (September 2009). "Identification and Quantification of Glycoproteins Using Ion-Pairing Normal-Phase LC and MS". Molecular & Cellular Proteomics. 8 (9): 2170–2185. doi:10.1074/mcp.M900088-MCP200. PMC 2742440. PMID 19525481.