대규모 병렬 시퀀스 처리

Massive parallel sequencing

대량 병렬 시퀀싱 또는 대량 병렬 시퀀싱은 대량 병렬 처리 개념을 사용하여 DNA 시퀀싱에 대한 몇 가지 높은 처리량 접근 방식 중 하나입니다. 또한 차세대 시퀀싱(NGS) 또는 2세대 시퀀싱이라고도 합니다.이 기술들 중 일부는 1994년과[1][2][3][4] 1998년 사이에 등장했고 2005년부터 상업적으로 이용되고 있다.이러한 기술은 소형화되고 병렬화된 플랫폼을 사용하여 계측기 실행당 100만~430억 개의 짧은 읽기(각각 50~400 베이스)를 시퀀싱합니다.

많은 NGS 플랫폼에서는 엔지니어링 구성 및 시퀀싱 화학이 다릅니다.이들은 공간적으로 분리된 복제 증폭된 DNA 템플릿 또는 플로우 셀의 단일 DNA 분자를 통해 대규모 병렬 시퀀싱의 기술적 패러다임을 공유합니다.이 설계는 개별 시퀀싱 [5]반응에서 생성된 체인 종단 제품의 전기영동 분리에 기반한 모관 시퀀싱 또는 1세대 시퀀싱이라고도 하는 Sanger 시퀀싱과는 매우 다릅니다.

NGS 플랫폼

시판되고 있는 NGS 플랫폼을 사용한 DNA 염기서열 처리는 일반적으로 다음 단계로 수행됩니다.우선 시험관 내 PCR에 의한 클론 증폭에 의해 DNA 배열 라이브러리를 생성한다.둘째, DNA 배열을 합성에 의해 배열하고, 연쇄 종단 화학이 아닌 상보적 가닥에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 DNA 배열을 결정한다.셋째, 공간적으로 분리된 증폭된 DNA 템플릿은 물리적 분리 단계를 필요로 하지 않고 대규모 병렬 방식으로 동시에 배열된다.대부분의 NGS 플랫폼에서는 이러한 절차를 따르지만 각각 다른 [6]전략을 사용합니다.

염기서열 반응의 NGS 병렬화는 단일 기기 실행에서 수백 메가베이스에서 기가베이스까지의 뉴클레오티드 염기서열 판독을 생성한다.이를 통해 이용 가능한 염기서열 데이터가 대폭 증가하고 생물의학에서 [7]게놈 염기서열 분석 접근법이 근본적으로 바뀌었다.새롭게 등장한 NGS 기술과 기구는 게놈 염기서열 [8][9]분석당 $1000에 근접하는 염기서열 분석 비용을 대폭 절감하는 데 기여했습니다.

2014년 현재 상용화된 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼과 그 기능이 표에 요약되어 있습니다.NGS 기술이 빠르게 발전하면서 기술사양과 가격도 유동적이다.

Illumina HiSeq 2000 시퀀싱 머신
NGS 플랫폼
플랫폼 템플릿 준비 화학 최대 읽기 길이(기본값) 실행 시간(일) 실행당 최대 Gb
로체 454 클론-엠PCR 파이로시퀀싱 400‡ 0.42 0.40-0.60
GS FLX 티타늄 클론-엠PCR 파이로시퀀싱 400‡ 0.42 0.035
일루미나 미세크 클론 브리지 증폭 가역성 염료 터미네이터 300 x 2 0.17-2.7 15
일루미나 하이세크 클론 브리지 증폭 가역성 염료 터미네이터 150 x 2 0.3-11[10] 천[11]
일루미나 게놈 분석기 IIX 클론 브리지 증폭 가역성 염료[12][13] 터미네이터 150 x 2 2-14 95
라이프 테크놀로지 SOLiD4 클론-엠PCR 올리고뉴클레오티드8-mer사슬결합[14] 20-45 4-7 35-50
라이프 테크놀로지 이온[15] 프로톤 클론-엠PCR 네이티브 dNTP, 양성자 검출 200 0.5 100
완전한 Genomics 격자형 DNA 나노볼 올리고뉴클레오티드9-mer Uncained[16][17][18] 결찰 10시간 365일 11 3000
헬리코스 바이오사이언스 헬리스코프 단일 분자 가역성 염료 터미네이터 35‡ 8 25
태평양 바이오사이언스 SMRT 단일 분자 형광 뉴클레오티드 10,000(N50), 30,000 이상(최대)[19] 0.08 0.5[20]


싱글 엔드 시퀀싱을 위한 실행 시간 및 실행당 기가베이스(Gb) 출력이 표시됩니다.페어링된 엔드 시퀀싱을 수행할 때 실행 시간과 출력이 약 두 배로 증가합니다.§ Roche 454 및 Helicos Biosciences [21]플랫폼의 평균 읽기 길이.

NGS 템플릿 준비 방법

NGS 반응을 위한 템플릿 준비에는 단일 DNA 분자에서 유래한 증폭 템플릿과 단일 DNA 분자 템플릿의 두 가지 방법이 사용됩니다.단일 형광 이벤트를 검출할 수 없는 영상 시스템의 경우, DNA 템플릿의 증폭이 필요합니다.가장 일반적인 세 가지 증폭 방법은 에멀전 PCR(emPCR), 롤링 서클 및 고체상 증폭입니다.템플릿의 최종 분포는 공간적으로 랜덤할 수도 있고 그리드 상에 있을 수도 있습니다.

에멀젼 PCR

에멀젼 PCR 방법에서는 우선 게놈 DNA의 랜덤 단편화를 통해 DNA 라이브러리가 생성된다.단일 가닥 DNA 조각(템플릿)은 어댑터 또는 링커로 비즈 표면에 부착되며, 하나의 구슬은 DNA 라이브러리에서 단일 DNA 조각에 부착됩니다.구슬의 표면은 DNA 조각과 결합하는 어댑터에 상보적인 배열이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함합니다.그런 다음 비즈는 물-오일 유화액 방울로 구분됩니다.수성 유화액에서, 하나의 구슬을 포착하는 각각의 물방울은 단일 DNA [22][23][24]템플릿의 증폭된 복사본을 생성하는 PCR 마이크로 리액터이다.

격자형 롤링 서클 나노볼

용액의 압연원 증폭에 의한 단일 DNA 분자 집단의 증폭에 이어 고정화 [25][26][27][28]대상 DNA보다 작은 크기의 스팟 그리드에서의 포착이 이루어진다.

DNA 콜로니 생성(브릿지 증폭)

플로우 셀 내의 슬라이드에 정방향 및 역방향 프라이머가 고밀도로 공유 부착되어 있다.서포트의 템플릿에 대한 프라이머의 비율은 증폭된 클러스터의 표면 밀도를 정의합니다.플로우 셀은 중합효소 기반 확장을 위해 시약에 노출되며, 프라이밍은 연결된 조각의 자유/원거리 끝이 표면의 상보적 올리고에 "교량"되면서 발생합니다.변성과 확장을 반복하면 플로우 셀 표면 전체에 걸쳐 수백만 개의 개별 위치에서 DNA 조각이 국소적으로 증폭됩니다.고체상 증폭은 공간적으로 분리된 1억~2억 개의 템플릿 클러스터를 생성하며, 범용 시퀀싱 프라이머를 교배하여 시퀀싱 [22][23]반응을 시작하는 자유단을 제공한다.이 기술은 1997년 파스칼 메이어(fr), 에릭 카와시마, 로랑 [3][4]파리넬리 등이 글락소 웰컴의 제네바 생물의학연구소(GBRI)에 출원해 [29]1998년 처음 공개됐다.1994년 Chris Adams와 Steve Kron은 1997년 Church와 Mitra에 [25][26]의해 클론 증폭에 적합한 유사하지만 복제되지 [2]않은 표면 증폭 방법에 대한 특허를 출원했습니다.

단일 분자 템플릿

DNA 증폭이 필요한 프로토콜은 종종 구현이 번거롭고 시퀀스 오류가 발생할 수 있습니다.단분자 템플릿의 준비는 보다 간단하며 PCR이 필요하지 않으므로 증폭된 템플릿에 오류가 발생할 수 있습니다.AT가 풍부하고 GC가 풍부한 표적 배열은 종종 증폭 편향을 나타내며, 이는 게놈 정렬 및 조립에서 표현력이 떨어지는 결과를 초래한다.단일 분자 템플릿은 보통 적어도 세 가지 다른 접근법 중 하나를 사용하여 고체 지지대 위에 고정된다.첫 번째 접근법에서는 공간적으로 분포된 개별 프라이머 분자가 고체 지지체에 공유적으로 부착된다.시작 재료를 임의로 작은 크기(예: 200~250bp)로 분할하고 조각 끝에 공통 어댑터를 추가하여 제조한 템플릿은 고정화된 프라이머에 하이브리드화됩니다.두 번째 방법에서는 공간적으로 분산된 단일 분자 템플릿을 고정화된 프라이머에서 프라이밍 및 신장함으로써 고체 지지체에 공유적으로 부착한다.그런 다음 공통 프라이머가 템플릿에 하이브리드됩니다.어느 쪽이든 DNA 중합효소는 고정화된 프라이밍 템플릿 구성에 결합하여 NGS 반응을 시작할 수 있다.위의 두 가지 접근법 모두 헬리코스 바이오사이언스에 의해 사용됩니다.제3의 어프로치에서는 공간적으로 분산된 단일 중합효소 분자를 프라이밍된 템플릿 분자가 결합되어 있는 고체 지지체에 부착한다.이 접근방식은 태평양 생물과학에서 사용합니다.더 큰 DNA 분자(최대 수만 개의 염기쌍)를 이 기술과 함께 사용할 수 있으며, 처음 두 가지 접근법과는 달리 세 번째 접근법은 실시간 방법으로 사용할 수 있어 판독 길이가 길어질 수 있습니다.

시퀀싱 어프로치

파이로시퀀싱

1996년 폴 니렌과 스톡홀름 왕립공과대학의 학생 모스타파 로나기는 파이로시퀀싱 [1]방법을 발표했다.파이로시퀀싱은 일련의 효소 반응을 이용하여 무기 피로인산염의 방출을 비례적으로 가시광선으로 변환하여 측정하는 비전기영동 생물발광법이다.DNA 합성을 끝내기 위해 수정된 뉴클레오티드를 사용하는 다른 배열 방법과는 달리, 파이로시퀀싱 방법은 제한량에 dNTP를 한 번 첨가함으로써 DNA 중합효소를 조작한다.상보적인 dNTP가 결합되면 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하고 일시 정지한다.DNA 합성은 분사 사이클에서 다음 상보적 dNTP를 추가한 후 재활성화된다.빛의 피크의 순서와 세기는 플로그램으로 기록되며, 이것은 기초적인 DNA 서열을 드러냅니다.[30]

가역 터미네이터 화학에 의한 시퀀스 처리

이 접근법은 뉴클레오티드 혼입, 형광 이미징 및 분할을 포함하는 순환적 방법으로 가역적 종단 결합 dNTP를 사용한다.형광표지 터미네이터는 각 dNTP가 첨가될 때 촬상되며 다음 염기를 삽입할 수 있도록 분해된다.이러한 뉴클레오티드는 화학적으로 차단되어 각각의 결합이 독특한 사건이다.촬상 공정은 각 염기 혼입 공정을 따르며, 다음으로 DNA 중합효소에 의한 혼입에 대비하여 차단된 그룹을 화학적으로 제거한다.이 일련의 단계는 사용자 정의 계측기 설정에 따라 특정 사이클 수 동안 계속됩니다.3' 차단 그룹은 원래 효소적[31] 또는 화학적[12][13] 반전이라고 생각되었습니다. 화학적 방법은 Solexa 및 Illumina 기계의 기초가 되어 왔습니다.가역 터미네이터 화학에 의한 시퀀싱은 Illumina/Sollexa에서 사용되는 4색 사이클 또는 Helicos BioSciences에서 사용되는 1색 사이클이 될 수 있습니다.헬리코스 바이오사이언스는 억제제 역할을 하는 두 번째 뉴클레오사이드 유사체가 있는 차단되지 않은 종단자 "가상 종단자"를 사용했다.이들 터미네이터는 단일 염기 [23][32][33]첨가 후 DNA 합성이 종료되도록 그룹을 종료하거나 억제하기 위한 적절한 수정사항을 가지고 있다.

리가아제 효소에 의해 매개되는 결찰별 배열 분석

이 접근법에서 배열 확장 반응은 중합효소에 의해 이루어지는 것이 아니라 DNA 연결효소 및 1염기 부호화 프로브 또는 2염기 부호화 프로브에 의해 이루어진다.가장 간단한 형태에서 형광 라벨이 부착된 프로브는 프라이밍된 템플릿에 인접한 상보적인 배열로 교배된다.이어서 DNA 연결효소가 첨가되어 염료표지 프로브를 프라이머에 결합한다.비결합 프로브를 씻어낸 후 형광 이미징을 실시하여 결합 프로브의 동일성을 판정한다.분해성 프로브를 사용하여 형광 염료를 제거하고 후속 결찰 사이클(체인[14][34] 결찰)을 위해 5µ-PO4 그룹을 재생성하거나 새 프라이머를 제거하여 템플릿에 하이브리드(미결찰[16][17])하여 사이클을 반복할 수 있습니다.

형광 뉴클레오티드 또는 실시간 배열 분석

현재 이 방법은 Pacific Biosciences가 주도하고 있습니다.실시간 배열 방법은 DNA 합성 중 염료 라벨이 부착된 뉴클레오티드의 연속적인 결합을 이미지화하는 것을 포함한다: 단일 DNA 중합효소 분자는 포스포린화 뉴클레오티드가 통합되는 동안 배열 정보를 얻을 수 있는 개별 제로 모드 도파관 검출기(Zmw 검출기)의 밑면에 부착된다.자라나는 프라이머 가닥에 스며들었습니다.Pacific Biosciences는 독특한 DNA 중합효소를 사용하여 포스포링크된 뉴클레오티드를 더 잘 통합하고 닫힌 원형 템플릿을 다시 정렬할 수 있습니다.단일 읽기 정확도는 87%이지만, 합의 정확도는 멀티킬로베이스 읽기 [35][36]길이에서 99.999%로 입증되었습니다.2015년 Pacific Biosciences는 Sequel System이라는 새로운 시퀀싱 기기를 출시했는데, 이 기기는 용량을 약 6.5배 [37][38]증가시킵니다.

「 」를 참조해 주세요.

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