사이클링 프로브 기술

Cycling probe technology

사이클링 프로브 기술(CPT)은 특정 DNA 염기서열을 검출하기 위한 분자생물학 기법이다.CPT는 등온 조건에서 작동한다.일부 애플리케이션에서 CPT는 PCR의 대안을 제공한다.그러나, PCR과 달리, CPT는 대상 DNA 자체의 복수의 복사본을 생성하지 않으며, 신호의 증폭은 선형이며, PCR에서 대상 DNA의 지수적 증폭과는 대조적이다. CPT는 보완 대상 DNA 염기서열로 혼합되어 RNase H. 클레바지의 기질이 되는 시퀀스 특정 치메릭 탐침을 사용한다.RNA 내부핵화합물 링크에서 발생하여 대상으로부터 탐촉자가 분리되어 다음 탐촉자 분자가 이용할 수 있게 된다.[1]CPT에서 사용하기 위해 통합된 전기동학 시스템이 개발되었다.[2]

프로브

사이클링 프로브 기술은 특정한 DNA 염기서열의 존재를 감지하기 위해 키메릭 핵산 탐침을 사용한다.치메릭 프로브는 두 개의 DNA 부분 사이에 낀 RNA 부분으로 구성된다.RNA 부분에는 4개의 연속적인 퓨린 뉴클레오티드가 포함되어 있다.탐침의 길이는 30 뉴클레오티드 미만이어야 하며 프로브 내 및 프로브 간 상호작용을 최소화하도록 설계되어야 한다.[3]

과정

사이클링 프로브 기술은 키메릭 프로브가 표적 DNA와 혼성되면서 시작되는 순환 등온 과정을 활용한다.일단 잡종화되면 탐침은 내분비인 RNase H. RNase H에 적합한 기질이 되어 탐침의 RNA 부분을 갈라 두 개의 치메릭 파편이 생긴다.새로 쪼개진 파편의 용융온도(Tm)는 원래 프로브의 용융온도보다 낮다.CPT 반응은 반대로 원래 프로브의 용해점 바로 위에서 유지되기 때문에, 분해된 파편들은 대상 DNA와 분리된다.일단 분리된 대상 DNA는 새로운 탐침과 자유롭게 혼합되어 다시 순환을 시작한다.[3][4]

파편들이 갈라지고 분리된 후에, 그것들은 감지될 수 있게 된다.파편을 감지하기 위한 일반적인 전략은 형광을 포함한다.이 방법으로 탐침의 5' 끝에는 형광 마커를 부착하고 탐침의 3' 끝에는 퀀셔를 부착한다.[4][5]RNase H가 프로브를 분해하면 퀀처와 형광 마커가 분리되어 형광 마커의 강도가 높아진다.분해된 파편은 증폭(예: PCR) 또는 다른 화학적 검출 수단이 가능하도록 추가 수정을 통해 검출할 수 있다.[6]

작은 농도의 표적 DNA로 작업할 때, CPT 프로토콜을 수정하여 특수성과 효율성을 높일 수 있다.할당된 시간 증가가 프로브 갈라짐 효율을 향상시키는 것으로 나타났다.[4]RNase H 농도의 증가와 프로브 간 및 프로브 내 상호작용에 취약하지 않은 프로브의 사용 모두 특수성을 증가시키는 것으로 나타났다.[3]

이점

사이클링 프로브 기술은 대상 DNA의 증폭을 수반하지 않기 때문에 CPT는 PCR에 비해 교차오염 위험이 낮다.[3][4]게다가, CPT는 PCR보다[4] 더 빠르고 전문화된 열전사기를 필요로 하지 않는다.CPT는 또한 겔로 CPT 제품을 실행할 필요가 없다.

단점들

CPT는 전문 치맥 탐침을 필요로 하기 때문에 PCR보다 CPT 검사를 더 비싸게 만든다.[5]CPT 프로브는 매우 구체적이기 때문에 새로운 프로브를 각각의 고유한 검사를 위해 설계해야 하며, 비용은 더욱 증가한다.임상 구현은 재정적으로 저해되지만, RNase H 이외의 비특정 RNAS를 함유한 샘플의 가능성에 의해서도 제한된다.[3]

적용들

CPT는 특정 DNA 서열과 확장자에 의해 특정 유전자형을 검출하는 데 사용될 수 있다.예를 들어 CPT는 GMO 생산물과 비 GMO 생산물을 구별하기 위해 사용될 수 있다.[5]임상적으로 CPT는 병원체의 항균저항을 감지하기 위해 세포 배양 대안으로 사용될 수 있다.[4]

CPT는 그 핵심에서 샘플에 특정 시퀀스가 있는지 여부를 감지한다.그러나 분해된 탐침은 선형 속도 운동학에 따라 축적되기 때문에 대상 DNA의 양을 정량화할 수 있다.따라서 CPT는 유기체의 비코딩 반복측정 횟수를 정량화하는 데 사용되어 왔다.[3]

CPT는 분자 비콘과 qPCR과 같은 다른 기술과 함께 사용될 수 있다.[7]

참조

  1. ^ Bhatt R, Scott B, Whitney S, Bryan RN, Cloney L, Lebedev A (1999). "Detection of nucleic acids by cycling probe technology on magnetic particles: high sensitivity and ease of separation". Nucleosides & Nucleotides. 18 (6–7): 1297–9. doi:10.1080/07328319908044696. PMID 10474219.
  2. ^ Tang T, Badal MY, Ocvirk G, Lee WE, Bader DE, Bekkaoui F, Harrison DJ (February 2002). "Integrated microfluidic electrophoresis system for analysis of genetic materials using signal amplification methods". Analytical Chemistry. 74 (4): 725–33. doi:10.1021/ac010874j. PMID 11866051.
  3. ^ a b c d e f Beggs ML, Cave MD, Marlowe C, Cloney L, Duck P, Eisenach KD (December 1996). "Characterization of Mycobacterium tuberculosis complex direct repeat sequence for use in cycling probe reaction". Journal of Clinical Microbiology. 34 (12): 2985–9. doi:10.1128/JCM.34.12.2985-2989.1996. PMC 229446. PMID 8940435.
  4. ^ a b c d e f Fong WK, Modrusan Z, McNevin JP, Marostenmaki J, Zin B, Bekkaoui F (July 2000). "Rapid solid-phase immunoassay for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using cycling probe technology". Journal of Clinical Microbiology. 38 (7): 2525–9. doi:10.1128/JCM.38.7.2525-2529.2000. PMC 86959. PMID 10878037.
  5. ^ a b c Buh Gasparic M, Cankar K, Zel J, Gruden K (March 2008). "Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms". BMC Biotechnology. 8: 26. doi:10.1186/1472-6750-8-26. PMC 2322970. PMID 18325084.
  6. ^ Wolcott MJ (October 1992). "Advances in nucleic acid-based detection methods". Clinical Microbiology Reviews. 5 (4): 370–86. doi:10.1128/cmr.5.4.370. PMC 358255. PMID 1423216.
  7. ^ Jacroux T, Rieck DC, Cui R, Ouyang Y, Dong WJ (January 2013). "Enzymatic amplification of DNA/RNA hybrid molecular beacon signaling in nucleic acid detection". Analytical Biochemistry. 432 (2): 106–14. doi:10.1016/j.ab.2012.09.015. PMC 3522425. PMID 23000602.