혜성분석
Comet assay |
단일 세포 젤 전기영양 검사(SCGE, 혜성 검사라고도 함)는 개별 진핵 세포 수준에서 DNA 손상을 검출하기 위한 복잡하고 민감한 기술이다. 1984년 외스틀링&요한슨에 의해 처음 개발되었고 이후 1988년 싱 외 에 의해 수정되었다.[1] 이후 DNA 손상/수리, 바이오모니터링, 유전독성 테스트 등의 평가를 위한 표준 기법으로 인기가 높아졌다. 그것은 낮은 용해 지점의 아가로스 정지에서 세포의 캡슐화, 중성 또는 알칼리성 상태의 세포의 용해(pH>13), 부유된 라이스 세포의 전기영양화를 포함한다. "코메트"라는 용어는 종종 혜성을 닮은 전기영동 젤을 통한 DNA 이동 패턴을 말한다.[2][3]
혜성 어세이(단세포 겔 전기영양증)는 진핵 세포에서 디옥시리보핵산(DNA) 스트랜드 파손을 측정하는 간단한 방법이다. 현미경 슬라이드의 아가로스에 내장된 세포는 세제와 고염분을 사용하여 핵 매트릭스와 연결된 DNA의 슈퍼코일 루프를 포함하는 뉴클레오이드를 형성한다. 높은 pH에서의 전기영양증은 형광 현미경 검사에 의해 관찰되는 혜성과 유사한 구조를 초래한다; 머리와 관련된 혜성 꼬리의 강도는 DNA 파괴의 수를 반영한다. 이것의 가능한 근거는 휴식을 포함하는 루프가 슈퍼코일을 잃고 양극으로 자유롭게 확장된다는 것이다. 이는 DNA의 얼룩을 이용한 시각적 분석과 DNA 손상 정도를 결정하기 위한 형광 계산이 이어진다. 이것은 수동 채점이나 영상 소프트웨어에 의해 자동으로 수행될 수 있다.[4][5]
절차
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캡슐화
체외 세포 배양 또는 체내 테스트 대상으로부터 추출된 세포 샘플은 개별 세포로 분산되어 37°C에서 용융된 저융점 아가로스에 매달려 있다. 이 모노 정지는 현미경 슬라이드에 주조된다. 유리 커버 슬립을 비스듬히 잡고 커버 슬립과 슬라이드 사이의 접촉 지점에 가해지는 모노-서스펜션을 적용한다. 커버립을 미끄럼틀 위로 내리면 용해된 아가로스가 퍼져 얇은 층을 형성한다. 아가로스는 4 °C에서 겔 화되며 커버립은 제거된다.
아가로스는 탄수화물 섬유 행렬을 형성하여 세포들을 캡슐화하여 제자리에 고정시킨다. 아가로스는 삼투성 중성인 것으로 간주되기 때문에 용액은 세포의 위치가 바뀌지 않고 젤로 침투하여 세포에 영향을 줄 수 있다.
시험관내 연구에서 세포는 캡슐화된 세포에서 DNA 손상을 유도하기 위해 테스트 물질(일반적으로 UV 빛, 이온화 복사 또는 유전독성 화학 물질)에 노출될 것이다. 교정을 위해 과산화수소는 보통 표준화된 수준의 DNA 손상을 제공하기 위해 사용된다.
용해
그런 다음 슬라이드는 세포가 침전하도록 하는 용액에 담근다. 혜성 검사에 자주 사용되는 용액은 고농축 수용액(흔히 일반 식탁용 소금을 사용할 수 있음)과 세제(트리톤 X-100 또는 사코사틴 등)로 구성된다. 용해액의 pH는 연구원이 조사 중인 손상 유형에 따라 (보통 중성 pH와 알칼리 pH 사이에서) 조절할 수 있다.
수성 소금은 단백질과 세포 내의 결합 패턴을 교란시키고 세포의 RNA 함량을 교란시킨다. 그 세제는 세포막을 용해시킨다. 용해제의 작용을 통해 세포는 파괴된다. 모든 단백질, RNA, 세포막, 세포질 및 핵질 성분은 분열되어 아가로스 행렬로 확산된다. 세포의 DNA만이 남아 있고, 세포 전체가 이전에 채웠던 한천장의 충치를 채우기 위해 풀린다. 이 구조를 뉴클레오이드(DNA가 밀집된 구조의 총칭)라고 한다.
전기영양증
셀을 용해한 후(일반적으로 4°C에서 1~2시간) 슬라이드를 증류수로 씻어 모든 염분을 제거하고 두 번째 용액인 전기영양 용액에 담근다. 또한 이 용액은 조사 중인 손상 유형에 따라 pH를 조정할 수 있다.
슬라이드는 전기장을 적용하기 전에 전기장치에 최대 20분간 남겨둔다. 알칼리성 상태에서는 DNA 이중나선이 변성되고 핵은 단일 좌초된다.
전기장(일반적으로 1 V/cm)을 ~ 20분 동안 적용한다. 그런 다음 슬라이드를 pH 7로 중화시켜 DNA 고유의 형광 얼룩으로 얼룩지게 하고 이미지 분석 소프트웨어로 컴퓨터에 연결된 부착된 CCD(충전 결합 장치 - 본질적으로 디지털 카메라)로 현미경을 사용하여 분석한다.
배경
SCGE 검사의 기본 개념은 손상되지 않은 DNA가 핵에 있는 매트릭스 단백질과 고도로 조직화된 연관성을 유지한다는 것이다. 손상을 입으면 이 조직은 혼란에 빠진다. DNA의 개별 가닥들은 그들의 콤팩트한 구조를 잃고 긴장을 풀면서 충치에서 한가로스로 확장된다. 전기장을 적용하면 전체 음전하를 갖는 DNA가 양극을 향해 그려진다. 손상되지 않은 DNA 가닥은 너무 커서 충치를 떠나지 않는 반면, 조각이 작을수록 일정 시간 내에 자유롭게 움직일 수 있다. 따라서 충치를 떠나는 DNA의 양은 세포 내 DNA 손상 정도를 측정하는 척도다.
영상 분석은 마이그레이션된 DNA의 형광과 전체 핵에 대한 형광의 전체 강도를 측정하고 두 신호를 비교한다. 이주된 DNA로부터 오는 신호가 강할수록 더 많은 손상이 존재한다. 전체적인 구조는 손상되지 않은 DNA와 손상된 DNA의 꼬리에 해당하는 원형 머리를 가진 혜성('코메트 어세이')을 닮았다. 꼬리가 밝고 길수록 손상 정도가 높다.
혜성 분석은 손상을 감지하기 위한 다용도 기법이며 프로토콜의 조정으로 다양한 DNA 변형 병변(손상)의 존재를 정량화하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 감지되는 손상은 단일 가닥 파손과 이중 가닥 파손이다. 때로는 알칼리성 상태와 DNA의 완전한 변이화가 단일 가닥의 파손을 감지하기 위해 필요하다고 명시되어[6][7] 있다. 그러나 이는 사실이 아니며, 중립 조건에서도 단일 및 이중 스트랜드 파손이 감지된다.[8][9][10][11] 그러나 알칼리성 조건에서는 추가 DNA 구조가 DNA 손상으로 검출된다. AP 사이트(피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오티드가 누락된 아바스 사이트) 및 절개 수리가 이루어지고 있는 사이트.[12][13]
혜성 측정은 극도로 민감한 DNA 손상 측정이다. 이러한 민감성은 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있는 물리적 변화에도 취약하기 때문에 주의 깊게 다룰 필요가 있다. 기본적으로, 연구 중인 요소를 제외하고 DNA 손상이나 변성을 일으킬 수 있는 모든 것은 피해야 한다.[14] 아직 확정적인 알칼리성 검사 프로토콜은 없지만, 검사의 가장 일반적인 형태는 알칼리성 버전이다. 간단하고 저렴한 설정 때문에 더 복잡한 검사를 사용할 수 없는 조건에서 사용할 수 있다.
적용들
여기에는 유전독성 시험, 인간 생물역학 및 분자 역학, 생태독성학, DNA 손상 및 수리에 대한 기초 연구가 포함된다.[15]
정자 DNA 조각화
혜성 분석은 정자 세포의 DNA 조각화 정도를 결정할 수 있다. DNA 조각화의 정도는 체외 수정 결과와 관련이 있다.[16][17]
이 혜성은 남성 불임 진단 도구로 정자 세포와 함께 사용하도록 수정되었다.
정자를 위해 혜성을 이용하기 위해서는 이러한 단단히 묶인 프로토마민 단백질을 분해하기 위해서는 탈응축 프로토콜의 추가 단계가 필요하다.[19]
참조
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- ^ Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (Apr 2011). "Evaluation of DNA damage using single-cell gel electrophoresis (Comet Assay)". J Pharmacol Pharmacother. 2 (2): 107–11. doi:10.4103/0976-500X.81903. PMC 3127337. PMID 21772771.
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추가 읽기
- Dawan & Anderson(2009): 독성학의 혜성 어세이. doi:10.1039/9781847559746
- Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth; Rinkevich, Baruch (2002). "Genotoxicity of the Kishon River, Israel: the application of an in vitro cellular assay". Mutation Research. 518 (1): 21–37. doi:10.1016/S1383-5718(02)00069-4. PMID 12063064.
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