명료함

CLARITY

조직 투명acrylamide-based hydrogels 내에서 그리고 조직과 연결되어 사용을 만드는 CLARITY[1] 방법, 가장 초기 종이에 정의된,"원상태의 생물 조직의 구체적인 요소들은 새로운 접근성 또는 기능을 제공한다 외인성 요소와 교체된 하이브리드 형태로 변환을 나타냅니다.권투 선수 muhammedali는ty".[1] 항체나 유전자 기반 라벨을 동반할 경우, CLARITY는 장기, 특히 뇌의 단백질과 핵산 구조를 매우 상세하게 묘사할 수 있다.그것은 스탠포드 의과대학의 정광훈과 칼 데이세롯에 의해 개발되었다.[2]

몇몇 발표된 논문들은 인간 유방암에 대한 면역 종양학,[3] 알츠하이머병 인간 뇌,[4] 쥐 척수,[5] 다발성 경화 동물 모델,[6] 식물과 같은 광범위한 조직과 질병 상태에 CLARID 방법을 적용했다.[7]CLARITY는 또한 콘코컬 확장 현미경, SPIM 라이트 시트 현미경, CLARITY 최적화 라이트 시트 현미경(CORM)을 포함한 새로운 현미경 방법을 개발하기 위해 다른 기술과 결합되었다.[8]

절차

CLARITY 기법을 통해 촬영한 3차원 영상으로서 마우스 해마의 1mm 슬라이스를 보여준다.다른 색깔들은 형광 항체로 얼룩진 단백질을 나타낸다.흥분성 뉴런은 녹색, 억제성 뉴런은 빨간색으로, 아스트로시테스는 파란색으로 표시된다.

CLARITY 영상을 적용하는 과정은 사후 조직 샘플로 시작한다.조직 유형에 따라 검체 고정 후 탈염 또는 탈색 등의 전처리 단계가 필요할 수 있다.다음으로 일련의 화학적 치료법을 적용하여 시료의 지질 함량이 제거되고 원래의 단백질과 핵산이 거의 모두 제자리에 남아 있는 투명성을 확보해야 한다.[1]그 목적은 조직을 투명하게 만들어 그 구성성분(주로 단백질과 핵산)의 미세한 정밀조사에 순응할 수 있게 하는 것이다.이를 위해서는 기존 단백질 구조를 보존하는 투명한 비계에 배치하고 지질 성분을 제거해야 한다.이 '스캐폴딩'은 아크릴아미드와 같은 하이드로겔 단조체로 이루어져 있다.포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타알데히드 등의 분자를 첨가하면 보존해야 할 단백질과 핵산에 비계를 쉽게 부착할 수 있으며, 세포성분과 아크릴아미드 사이의 실제 연계를 확립하기 위해 열을 가하는 것이 필요하다.[9]

이 단계가 완료되면 대상 조직 세포의 단백질과 핵산 성분이 제자리에 단단히 고정되고 지질 성분은 분리된다.그리고 나서 지질은 며칠에서 몇 주 사이에 세제의 수동적 확산을 위해 제거되거나, 전기영양법에 의해 몇 시간에서 며칠로 가속된다.[10][11]전기영양법으로 가속하려는 노력은 조직 손상을 야기하지 않는 능력에 대해 결론을 내리지 못하고 있다.그들이 통과할 때, 세제의 지방질 성질은 그것이 도중에 마주친 어떤 지질도 집어서 배설할 수 있게 해준다.DiI와 같은 지방질 염료는 제거되지만 인접 단백질에 고정될 수 있는 CLARID 호환 지방질 염료가 있다.[12]단백질과 DNA와 같은 대부분의 비지질 분자들은 아크릴아미드 젤과 관련된 분자들의 화학적 특성 덕분에 이 절차의 영향을 받지 않고 남아 있다.[9]

초기 논문에서 보고된 바와 같이 이 과정에서 조직은 팽창하지만, 필요에 따라 굴절률 매칭 용액에서 배양하는 최종 단계로 초기 치수로 회복할 수 있다.[1]조직 확장은 고유하게 지질이 풍부한 뇌에서 발생하지만, 다른 조직 유형은 그 과정 내내 많은 조직 확장을 경험하지 않는 것으로 알려져 있다.

이 과정에서 샘플은 이미징을 위해 완전히 준비되었다.영상촬영 대비는 내생 형광분자, 핵산(DNA 또는 RNA) 라벨 또는 면역력 검사에서 얻을 수 있으며, 특정 표적 물질에 특별히 결합되는 항체가 사용된다.또한 이러한 항체에는 최종 영상 결과의 핵심인 형광 태그가 부착되어 있다.표준 콘포칼라, 투포톤, 또는 광시트의 영상 방법은 모두 단백질 국산화 규모까지 방출되는 형광을 검출하는 데 적합하므로, CLARID가 생성하는 최종 고도로 디테일하고 입체적인 영상을 얻을 수 있다.[9]

샘플이 영상에 대한 면역반응을 보인 후에는 항체를 제거하고 새로운 항체를 재응시할 수 있으므로 샘플이 여러 번 이미징되고 여러 단백질 유형을 대상으로 할 수 있다.[13][14]

적용들

뇌 이미징의 관점에서, 그러한 방해받지 않는 세부사항에서 특정 구조를 드러내는 CLARID 이미징의 능력은 국소 회로 배선(특히 Connectome Project와 관련됨), 신경 세포 사이의 관계, 세포 미만 구조의 역할, 프로에 대한 이해도 향상 등을 포함한 미래 응용 프로그램의 유망한 길들로 이어졌다.티인 복합체, 핵산 및 신경전달물질의 영상화.[1]CLARITY 영상을 통해 발견된 사례로는 뉴런이 자신과 이웃에게 다시 연결되는 독특한 '사다리' 패턴이 있는데, 동물에서 관찰되어 자폐증 같은 행동과 연결된다.[15]

CLARID 기법은 뇌를 넘어 여러 응용 분야로 확대되었다.[16]초기의 출판물을 기반으로 하기 위해 수많은 수정 사항이 발표되었으며, 광범위한 응용프로그램을 클리어리에 적용하기 위해 학문적으로나 생명공학 산업 내에서 모두 노력했다.CLARITY는 향후 임상 진단에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있는 새로운 기술로서 지속적으로 주목을 받고 있다.CLARID는 간, 췌장, 비장, 고환, 난소와 같은 대부분의 다른 기관과 제브라피쉬와 같은 다른 종들을 깨끗하게 하기 위해 거의 또는 전혀 변형 없이 사용될 수 있다.뼈는 간단한 탈색 단계를 필요로 하지만, 마찬가지로 식물 조직도 세포벽의 효소 분해 과정을 필요로 한다.[10]

NIH의 프랜시스 콜린스 국장은 이미 이 새로운 기술에 대한 희망을 다음과 같이 표현했다.[17]

"CLARITY는 강력하다.연구자들이 전지구적 시각을 잃지 않고 병들거나 손상된 구조물에 초점을 맞춰 신경학적 질병과 질환을 연구할 수 있게 된다.그것은 우리가 이전에는 결코 3차원으로 할 수 없었던 일이오."

— Francis Collins

제한 사항

비록 CLARITY 시술이 지질 추출 후 전례 없는 수준의 단백질 보존을 달성했지만, 이 기술은 여전히 세제 전기영동증 환자당 약 8%의 단백질을 손실한다.[13]항체 제거는 일반적으로 원래 표본을 생성하는 동일한 세제 과정을 통해 이루어지기 때문에 단일 표본을 반복해서 촬영하는 것은 이러한 손실을 증폭시킬 뿐이다.[9]그러나 그러한 계산은 실험 내내 전반적인 단백질 손실에 대한 일관된 방법이 부족한 것으로 보인다.칼 디세롯이 설립한 클리어라이트 바이오테크놀로지는 항체 제거를 위해 원래 발표된 세제 공정이 이상적인 접근법이 아니라는 것을 발견했고 조직 무결성에 그만큼 해롭지 않은 궁핍한 솔루션을 개발했다.

이 기술의 다른 잠재적인 단점은 샘플을 만들고 이미지화하는 데 걸리는 시간(이문항화학적 얼룩만 수행하는데 최대 6주가 소요됨)과 사용된 아크릴아미드가 독성이 강하고 발암성이 높다는 점이다.시간은 종종 CLARID 기법을 사용하는 데 있어 제한 요소와 단점으로 언급되어 왔지만, 여러 학술 및 생명공학 회사(Logos Bioscience, ClearLight Biologicals)는 면역 체계에 걸리는 시간을 6주에서 q로 크게 단축시키는 CLARID 시약을 지속적으로 개발 및 최적화해왔다.샘플 종류에 따라 일주일 정도로 이상하다.모든 조직 정리에는 자체적인 안전 문제가 있다.아크릴아미드는 독성이 있고 발암성이 있는 것으로 간주되지만, 그 성분은 서부 블롯에 사용되는 젤에서 발견되는 성분과 유사하다.

참고 항목

참조

  1. ^ a b c d e Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K (May 2013). "Structural and molecular interrogation of intact biological systems". Nature. 497 (7449): 332–7. Bibcode:2013Natur.497..332C. doi:10.1038/nature12107. PMC 4092167. PMID 23575631.
  2. ^ Underwood E (April 2013). "Neuroscience. Tissue imaging method makes everything clear". Science. 340 (6129): 131–2. doi:10.1126/science.340.6129.131. PMID 23580500.
  3. ^ Chen Y, Shen Q, White SL, Gokmen-Polar Y, Badve S, Goodman LJ (April 2019). "Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues". Scientific Reports. 9 (1): 5624. Bibcode:2019NatSR...9.5624C. doi:10.1038/s41598-019-41957-w. PMC 6449377. PMID 30948791.
  4. ^ Ando K, Laborde Q, Lazar A, Godefroy D, Youssef I, Amar M, Pooler A, Potier MC, Delatour B, Duyckaerts C (September 2014). "Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D". Acta Neuropathologica. 128 (3): 457–9. doi:10.1007/s00401-014-1322-y. PMC 4131133. PMID 25069432.
  5. ^ Zhang MD, Tortoriello G, Hsueh B, Tomer R, Ye L, Mitsios N, Borgius L, Grant G, Kiehn O, Watanabe M, Uhlén M, Mulder J, Deisseroth K, Harkany T, Hökfelt TG (March 2014). "Neuronal calcium-binding proteins 1/2 localize to dorsal root ganglia and excitatory spinal neurons and are regulated by nerve injury". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (12): E1149-58. Bibcode:2014PNAS..111E1149Z. doi:10.1073/pnas.1402318111. PMC 3970515. PMID 24616509.
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  15. ^ "See-through brains". Nature Video.
  16. ^ "Tissue Clearing Applications: CLARITY Beyond the Brain".
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