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가상 군집 수

Virtual colony count

VCC(Virtual colony count)는 디펜신의 활동을 측정하기 위해 원래 개발된 96웰 미생물학적 측정법이다.[1]이후 LL-37을 비롯한 다른 항균 펩타이드에도 적용됐다.[2]박테리아 배치 배양액이 임계 광학 밀도에 도달하는 데 걸리는 시간을 일련의 교정 곡선의 그것과 비교하는 정량적 성장 운동학이라는 박테리아를 열거하는 방법을 활용한다.또한 VCC라는 이름은 세포 배양 감염 모델에서 박테리아를 열거하기 위한 양적 성장 운동학의 적용을 설명하는 데 사용되었다.[3]항균 감수성 시험(AST)은 세균을 접종한 육수의 다양한 농도로 항균제를 희석하고 성장이 없는 최소 억제 농도를 측정해 96웰 플레이트에서 할 수 있다.그러나 이러한 방법은 육수 자체에 의해 억제되는 일부 막 활성 항균 펩타이드의 연구에는 사용할 수 없다.가상식민지 수속은 우선 박테리아 세포를 저염 완충기에 2시간 동안 활성 항균제에 노출시킨 뒤 동시에 항균 활동을 억제하고 육수를 첨가해 지수 성장을 유도하는 방식으로 이 같은 사실을 활용한다.생존 세포의 성장 동력학은 온도 조절 판 판독기를 사용하여 모니터링할 수 있다.각 성장 곡선이 광학 밀도의 임계 변화에 도달하는 데 걸리는 시간을 가상 생존 값으로 변환하여 항균 활성을 측정하는 역할을 한다.

항균 감수성 시험

항균제의 항균 활성을 시험하는 방법은 수십 년 동안 존재해 왔다.[4][5]전형적으로, 이것들은 박테리아의 강력한 성장을 가능하게 하는 영양소가 있는 곳에서 박테리아를 항균제에 노출시키는 것을 포함한다.실험은 고체 지지대로 한지를 함유한 접시나 한지가 없는 액체 육수에 대해 수행될 수 있다.[6]많은 작은 분자 항생제가 이러한 방법을 사용하여 개발되었다.그러나 연구자들이 항균 펩타이드의 항균 활성을 연구하려고 했을 때 합병증이 발생했다. 왜냐하면 항균 펩타이드들은 한판이나 육수에 공급되든 풍부한 매체에 의해 억제되기 때문이다.예를 들어, 데펜신은 인간을 포함한 많은 유기체의 선천적인 면역 체계의 일부인 항균 펩타이드다.이황화 본딩의 패턴을 바탕으로 알파, 베타, 세타 등 여러 구조 등급으로 나뉜다.중성미자의 과립에서 4개의 인간 알파 데펜신이 발견되며, 이를 인간 중성미 펩타이드(HNP) 1-4로 알려져 있다.데펜신 연구 초기에는 HNP가 생리학적 염분 농도에 의해 강하게 억제된다는 것이 밝혀졌다.HNP의 항균 활성을 측정하기 위해서는 별도의 초기 단계로서 낮은 염분 완충기에 있는 세포와 함께 배양해야 했고, 그 후에 풍부한 매체가 추가되어 생존자의 열거가 가능해졌다.생리학적으로 관련된 염분 농도를 가진 상태에서 데펜신 HNP1과 같은 펩타이드들을 검사할 방법이 없기 때문에, HNP1 활동을 측정하는 모든 검사들은 체내에 존재하는 것과 다른 조건을 사용한다.

재래식 군집 수

액체 내 항균 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 2시간 등 배양 시간 동안 항균제를 세포에 노출시킨 다음 혼합물을 희석한 다음 풍부한 매체가 들어 있는 한천판에 액체의 일부를 펴서 생존자를 열거하는 것이다.[2]배양 단계는 보통 96웰 플레이트에서 이루어진다.확산 후, 한천판은 하룻밤 사이에 배양되고 다음 날 군집 형성 단위(CFU)의 수가 계산된다.이러한 방법에는 희석 단계에서 도입된 부정확성과 판당 수용 가능한 수의 집락을 생산하기 위해 많은 수의 한천판이 필요할 가능성을 포함한 여러 가지 단점이 있다.[7]데펜신 등 항균제의 항균 활성을 측정하기 위해 10 mM sodium pH 7.4 등 저염 완충액에서 2시간 배양 단계를 실시한다는 점에 유의한다.

최소억제농도

액체 내 항균 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 96웰 플레이트에 뮬러-힌튼 육수(MHB)와 같은 풍부한 육수의 세포에 항균제의 희석 시리즈를 노출시킨 후 하룻밤 사이에 96웰 플레이트를 37°C로 배양하는 것이다.각각의 우물은 박테리아의 성장과 함께 탁해지거나 맑게 유지될 것이다.그런 다음 최소 억제농도(MIC)를 맑은 우물을 생성하여 성장을 억제하는 최저농도로 보고한다.[8]MHB를 이용한 표준화된 MIC 방법은 데펜신 등의 항균제에는 적용되지 않는데, 데펜신은 풍부한 육수가 아닌 저염 완충제에 배양해야 활동성을 측정할 수 있기 때문이다.

가상 군집 수

전통적인 군집계수법은 저염완충재에서 2시간 배양 후 2회 농축된 육수를 동일한 부피의 2회 농축된 육수를 첨가하여 우물 시료 채취와 한천판에 생존 세포 확산 없이 96-웰 플레이트의 항균 활성을 측정하도록 수정할 수 있었다.배양 기간이 끝날 때 배치 배양액을 이용해 얼마나 많은 세포가 살아남았는지를 판단할 수 있는 방법이 필요할 것이다.다행히 기하급수적인 성장의 수학은 바로 그 방법을 제공한다.96웰 플레이트 내 배치 배양액의 탁도, 즉 광학 밀도를 실시간으로 모니터링하여 우물이 문턱에 도달하는 데 필요한 시간을 기록하고 기하급수적으로 성장하는 세포의 2배 시간을 알면 접종에 원래 존재하는 세포의 수를 계산할 수 있다.이 세포의 시작 수는 항균제로 배양한 2시간 후에 생존하는 세포의 수와 같다.이 절차에는 실제 식민지 형성이나 군집 개수가 필요하지 않기 때문에 "가상 군집 개수"라고 불린다.지금까지 VCC 기술은 항균 펩타이드에 한정되었다.그것은 두 번 농축된 뮬러 힌튼 브룩스가 그 작용제의 항균 활동을 비활성화하는 한, 잠재적으로 다른 항균제들과 함께 작동할 수 있다.VCC 방법은 박테리아 활동이나 박테리아 활동을 감지할 수 있지만 구별할 수는 없다.그러나 박테리아 활동은 "입력" 제어와 "출력" 제어 사이의 임계값 시간 차이를 측정하여 정량화할 수 있다(아래 참조).

VCC 검사에 사용하기 위한 일반 실험실 절차

가상 군집 수 절차

2 mL의 박테리아 배양균을 단일 군락에서 접종하여 하룻밤 사이에 인산염 뮬러 힌튼(PMH)이나 인산염 뮬러 힌튼 트라이펙틱 소이 육수(PMHT) 매체에서 재배한다.PMH는 Mueller Hinton Breast와 10 mM sodium pH 7.4를 혼합한 것으로, cation-adjusted 또는 non-cation-adjusted MHB를 사용할 수 있다.일부 실험에서는 인산염 완충기에 1% TSB(Tryptic Soy Breast)가 있어 2시간 배양 시 디펜신 활성도를 높였다. 이 경우 1:1의 버퍼와 육수의 유사한 혼합물은 0.5% TSB를 함유하고 있으며 PMHT라고 불린다. 이 배양액의 250μl는 125 mL의 일회용 필터 플라스크에서 PMH 25 mL로 전달된다.이 배양액은 250rpm을 흔드는 37 °C에서 650 nm의 광학 밀도가 0.45 ~ 0.55 사이일 때까지 보통 2~3시간 동안 자란다.한편 항균펩타이드제는 10 mM sodium phosphate pH 7.4에 96웰 플레이트(조직 배양 처리된 코스타 3595)에서 희석하여 최종 부피가 90 마이크로리터로 한다.가상 군집 형성[1] 단위(CFUv)는 원래 VCC 간행물에 정의되어 있으며, 여기서 그 정의를 반복한다. 즉, CFUv는 각 실험에서 탁도, 따라서 세포막의 양이 대략 같도록 시험한 6가지 변종 중에서 일정하게 유지되었다.대장균 ATCC 25922의 CFU로 CFUv가 표준화되었기 때문에 CFUv가 아닌 CFU는 이러한 변종으로 보고할 수 있다.For the experimental portion of the assay, cells are diluted in 10 mM sodium phosphate pH 7.4 such that the final cell concentration in 10 microliters is 5x106 CFUv/mL. 10 μl of this cell suspension are pipetted beneath the 90 μl of antimicrobial peptides in solution, resulting in a cell suspension at the standard inoculum of 5x105 CFUv/mL during t그는 항균 펩타이드에 세포를 노출시켰다.96웰 플레이트의 여러 웰은 항균제에 노출되지 않는 제어장치에 사용된다. 이를 "출력" 제어라고 한다.그리고 나서 96웰의 판은 판 판독기에 2시간 동안 배양되었고, 5분마다 흔들어서 판독을 하도록 설정되었다.이 배양 기간 동안 종자 배양균은 얼음 위에 보관되었다.검정곡선의 경우 2시간 배양 후 종자배양 1 mL를 PMH 1.5 mL에 추가하여 108 CFUv/mL의 정지를 발생시켰다.이 서스펜션의 10배 희석 시리즈는 총 PMH 200 μl 부피에서 107 CFUv/ml에0 걸쳐 96 웰 플레이트의 8개 웰을 점유했다.이때, 어떤 항균제에도 노출되지 않은 세포는 얼음 위에 보관된 배양액에서 판의 몇몇 우물들에 첨가되었다; 이것들은 2시간 배양 시작 시에 존재하는 세포의 수를 나타내기 때문에 "입력" 조절제라고 불린다.처음에 발표된 VCC 실험에서는 12시간 배양 중에 증발로 에지 웰의 부피가 바뀌었기 때문에 플레이트의 내부 60개 웰만 사용하였다.그러나 96웰 플레이트의 모든 96개의 우물을 파라필름 M 6제곱 조각으로 감싸는 한 실험에 사용할 수 있다.가스를 흡수할 수 있는 파라필름은 세포호흡을 허용하면서 증발을 억제하고 플레이트 리더의 96웰 플레이트에 입자 물질이 날아드는 것을 방지한다.플레이트를 파라필름으로 감싸면 생물학적 안전 캐비닛에서 플레이트 리더로 옮겨진다.온도 조절 플레이트 리더의 여러 모델은 VCC 검사에 성공적으로 사용되었으며, 여기에는 따뜻한 방에 보관된 Max 분자 소자, 분자 소자 스펙트라맥스, Tecan Infinite M1000 등이 포함된다.플레이트 리더는 광학 밀도를 5분마다 650nm로 12시간씩 읽도록 설정돼 있다.Raw data(로우 데이터)를 Microsoft Excel로 가져와 매크로 VCC Calculate를 실행하여 각 성장 곡선이 0.02의 임계 광학 밀도에 도달하는 데 필요한 시간을 결정한다.

양적 성장 동력학

VCC 교정 곡선

VCC가 사용하는 생존 세포의 열거[9] 방법은 정량성장역학(QGK)이라고 하며, 96웰 마이크로 플레이트의 우물에서 박테리아 배치 미생물 배양균의 탁도에 걸리는 운동시간을 10배 희석된 일련의 교정 성장곡선에 대한 탁도차에 도달한다.

실행 가능한 세포 수의 정량화는 PCR 제품의 복사본이 아닌 QGK 세포가 기하급수적으로 증가하는 것을 제외하고 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(QPCR)과 수학적으로 동일한 과정을 사용하여 이루어진다.임계값에 도달하는 데 걸리는 시간을 "임계시간", T라고t 하며, 이는 QPCR 값 "주기시간" 또는 C와t 동일하다.

VCC 검사에서 임계값 시간 지연을 유발하는 프로세스는 5개 이상:

  1. 접착, 세포가 마이크로 플레이트에 들러붙게 하고 바이오필름을 형성할 수 있다.이러한 세포들이 광선 경로에 직접 있지 않는 한, 그들의 성장은 광학 밀도 측정치에 영향을 미치지 않을 것이다.
  2. 응집, 이항분열을 겪는 개별 세포의 균일한 중단 대신 다양한 크기의 덩어리로 세포가 집합하도록 하는 응집력.응집력은 T에t 부정확함과 변동을 일으킬 수 있다.응집성 덩어리도 접착제로 되어 있어 응집성에 의한 부정확성과 접착에 의한 부정확성(Tt 증가)으로 모두 이어질 수 있다.
  3. 박테리아 활동으로 인해 세포는 죽이지 않아도 기하급수적인 성장에 들어갈 수 없게 된다.일시적인 박테리아 활동으로 인해 지연 시간이 발생하여 T가 증가할t 수 있다.
  4. 박테리아 성장의 대사 지연 단계.이러한 지연 단계는 저염 완충제의 항균 펩타이드에 대한 초기 노출 중에 세포가 느리게 성장하거나 전혀 성장하지 않기 때문에 분석에서 발생할 것으로 예상된다.이 대사 지연 단계가 항균 펩타이드의 존재에서 증가한다면, 세포벽이나 세포막과 같은 손상된 세포 구조의 수리에 필요한 시간 때문에 지연과 같은 과도 박테리아 활동 다른 원천이 있더라도 상기 범주 3에서 일시적인 박테리아 활동으로 간주될 수 있다.목장들은 가능하다.
  5. 살인이거나 살인이거나생존 세포가 적으면 생존자들이 기하급수적인 성장을 통해 같은 양의 탁도를 생산하는 데 시간이 더 오래 걸리기 때문에 T에t 지연을 초래한다.만약t T의 증가를 유발하는 다른 모든 과정이 무시할 수 있다면, VCC 분석은 박테리아 분석 결과가 되고 T는t QGK에 의해 실행 가능한 박테리아를 열거하는 데 사용될 수 있다.이 단순화된 사례에서 VCC "가상 생존" 결과는 전통적인 군집 수 살균제 분석의 "생존" 결과와 동일하다.

박테리아

VCC는 처음에 대장균, 포도상구균 아우레우스, 바실러스 세레우스, 엔테로박터 에어로제 6종류에 대한 펩타이드의 항균 활성을 정량화하기 위해 채용되었다.[1]일반적으로 표준 Gram-negative와 Gram-positive의 품질 관리 변형률을 비교한다.대장균 ATCC 25922와 포도상구균 ATCC 29213이 각각 그람 음성 및 그람 양성 균주로 사용되어 왔다.VCC는 탄저균의 원인물질인 바실러스 무연탄에도 적용됐다.[10]이밖에 살모넬라 장티푸리움[11], 아시네토박터 바우만니이에도 VCC가 적용됐다.[12]

항균펩타이드

초기 가상 식민지 수 연구는 동일한 96웰 플레이트(HNP1, HNP2, HNP3, HNP4, HD5, HD6)에서 6개의 인간 알파 디펜신 모두의 활동을 동시에 측정했고,[1] 그 후 VCC에서 6개의 디펜신 중 일부 변형된 형태를 연구했다.HNP2의 베타 불지에 보존된 글리신은 일련의 D-아미노산으로 대체되어 VCC 활성도가 사이드 체인 친수성과 전하량에 비례하게 되었다.[13]VCC는 HNP2 활성화가 정전기량에 비례하는 N단계의 아세틸화 및/또는 C단계의 활성화가 있음을 보여주었다.[14]VCC 결과는 일련의 염교 파괴 돌연변이에 대한 충전량에 다시 비례하여 HNP2 기능에 염교가 필요하지 않음을 시사했다.[15]VCC는 프로펠러이드 HNP1의 N단자 자연 및 인공 프로 세그먼트의 중요성을 측정하여 대장균과 황색포도상구균에 대한 활동을 극적으로 변화시켰다.[16][17]전체적으로 D-아미노산으로 구성된 HNP1, HNP4, HD5, 베타-디펜신 2의 에난토머 형태는 그람 양성 박테리아와 그람 음성 박테리아에 대한 데펜신 활성의 다른 메커니즘을 제안했다.[18]HNP1의 조광 손상 모노머와 테더형 조광기의 VCC 결과는 조광화의 중요성을 입증했다.[19]보존된 글리신을 L-알라닌으로 교체한 결과 VCC가 미세하게 차이가 났다.[20]HNP1과[21][22] HD5의[23] 종합적인 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발은 부피가 큰 소수성 잔류물의 중요성을 보여주었다.HD5 이황화 환원제는 VCC 활동을 손상시켰지만 3Gram 음성 변종에 대한 지용성당 결합 활성을 강화했다.[11]이황화 본드가 1개 있거나 이황화 본드가 없는 HD5 변형은 A. 바우만니에 대한 VCC 활성도가 크게 줄어든 반면, 이황화 환원 및 아르기닌 도입에 의해 구성된 HD5의 단순화된 파생 모델은 A. 바우만니이의 다약 내성 변종에 대한 잠재적 활성을 보였다.[12]이러한 연구는 추가 베타 디펜신, 세타 디펜신,[10] 인간 카테리딘 LL-37 및 관련 펩타이드를 포함하도록 확장되었다.[2]

접종 효과

많은 항균제에는 이전에 예방접종 효과가 설명되어 있는데, 이는 검사에 더 많은 박테리아가 첨가되었을 때 그 작용제가 덜 효과적이다.[24]이러한 효과는 박테리아를 생성하는 베타 락타마아제에 대해 분석했을 때 베타 락탐에서 종종 관찰된다.접종 효과는 전통적인 군집 개수와 VCC를 나란히 포함하는 HNP1, 프로 LL-37 및 LL-37의 연구와 잠재적으로 관련이 있었다.[2]그 보고서에서, 전통적인 군집계수 생존 값이 모든 펩타이드와 균주의 가상 생존 값보다 낮은 것으로 밝혀졌다.VCC 검사에서 사용된 표준화된 기존 군집계수 프로토콜에 비해 박테리아 접종이 20배 이상 높았기 때문에, 높은 접종에서 m을 보였기 때문에 다른 항균제들과 함께 일반적으로 볼 수 있는 접종 효과의 역효과가 있었겠지만, 그 차이는 접종 효과에 기인할 수 있었다.광석 활동이러한 가능성은 주로 디펜신 HNP1과 세균성 변종 대장균, S. aureus, B. cereus에 초점을 맞춘 일련의 VCC 실험에서 조사되었다.6가지 실험 결과는 대장균에 대한 HNP1의 뚜렷한 접종 효과를 입증했다.[25]

양적 성장 동력학을 분석하는 알고리즘

가상 생존 및 가상 치사량 값 계산에 사용되는 복잡한 Microsoft Excel 스프레드시트와 임계값 시간을 계산하는 데 사용되는 Visual Basic 매크로가 발행되었다.[25]

안전하고 효과적인 피펫팅 기법

VCC 사용자는 위에 표시된 QGK 교정 곡선 및 초기 VCC 간행물에 보고된 교정 곡선과 유사한 90 마이크로리터 이하 10 마이크로리터와 같은 작은 볼륨의 셀을 전송할 것을 경고하지만,[1] 동일한 문서에서 디펜신 활동을 테스트하는 데 사용된 실험 절차와는 달리, 이 셀을 전달해야 한다.개선된 피펫팅 기술은 2011년 BSL-3) 병원체 바실러스 무연산염 연구에서 설명되었다.[10]2005년 발간된 원래 방식은 세포정지 50마이크로리터를 액상 50마이크로리터로 전달해 세포가 인산염 완충액 아래 우물 바닥에 직접 전달되면 탁도법과 양립할 수 없는 거품, 거품, 탁도 등을 발생시키는 내용을 담고 있다.위의 물방울로 셀 서스펜션을 추가하여 이 문제를 방지하면 에어로졸이 교차 오염을 일으킬 수 있다.[26]유해세균의 바이오에로스롤도 생체안전성 캐비닛 내에서 실험을 실시하면 줄일 수 있는 안전 위험을 내포할 수 있다.

참조

이 기사는 2019년 외부 학술 동료 검토를 위해 위키저널 사이언스지에 제출되었다(검토자 보고서).업데이트된 내용은 CC-BY-SA-3.0 라이센스(2021년)에 따라 위키백과 페이지로 다시 통합되었다.검토된 기록의 버전은 다음과 같다."Virtual colony count" (PDF). WikiJournal of Science. 3 (1): 3. 16 February 2020. doi:10.15347/WJS/2020.003. ISSN 2470-6345. Wikidata Q86161728.

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