형광 이미징

Fluorescence imaging
살아있는 Hela 세포의 다색 형광 이미지

형광 촬영은 살아있는 유기체에서 일어나는 생물학적 과정을 시각화하는 데 도움을 줄 수 있는 비침습적 영상 기법의 일종이다. 이미지는 현미경, 이미징 프로브, 분광기 등 다양한 방법으로 제작할 수 있다.

형광 그 자체는 전자기 방사선을 흡수하고 일정한 파장의 빛을 발하는 물질에서 비롯되는 발광의 한 형태다. 빛의 흡수에 따라 빛을 재 방출하는 분자를 불소포레라고 한다.[1][2]

형광 이미지 촬영은 분자 메커니즘과 구조를 표시하기 위해 형광 염료와 형광 단백질을 촬영한다. 살아있는 세포에서 유전자 발현, 단백질 발현, 분자 상호작용의 역학을 실험적으로 관찰할 수 있게 해준다.[3] 그것은 본질적으로 생화학적 응용에 관한 정밀한 정량적 도구로서의 역할을 한다.

일반적인 오해인 형광은 각 공정에서 나오는 단백질이 어떻게 빛을 생산하느냐에 따라 생물 발광과는 다르다. 생물 발광은 효소가 빛을 내기 위해 기질을 분해하는 화학적 과정이다. 형광은 전자의 물리적인 흥분이며, 이후 빛을 발산하기 위한 복귀다.

특성

형광 메커니즘

흡광과 형광 사이의 연결부를 보여주는 다이어그램

특정 분자가 빛을 흡수하면 분자의 에너지가 잠시 더 높은 흥분 상태로 상승한다. 이후 지상 상태로 복귀하면 감지 및 측정이 가능한 형광등이 방출된다. 에너지 hv의 흡수된 광자에서 발생하는 방출된 빛은 특정한 파장을 가지고 있다. 이 파장을 미리 알아두면 실험이 실행될 때 측정장치는 어떤 파장을 설정해 빛 생산을 감지할 수 있는지 아는 것이 중요하다. 이 파장은 다음 방정식에 의해 결정된다.

여기서 h = Planck의 상수, c = 빛의 속도. 일반적으로 대형 스캔 장치 또는 CCD는 강도를 측정하고 이미지를 디지털로 촬영하는 데 사용된다.[1]

형광 염료 대 단백질

형광 염료는 성숙 시간이 없는 형광 단백질에 비해 광의 안정성과 밝기가 높다. 밝기 측면에서 광도는 불소화물의 소멸 계수나 빛의 흡수 능력, 흡수된 빛을 형광 발광으로 변환하는 양자 효율이나 효과에 좌우된다. 염료 자체는 그다지 형광물질은 아니지만 단백질과 결합하면 더 쉽게 검출할 수 있게 된다. 한 예로 나노오렌지는 단백질의 코팅 및 소수성 부위와 결합하면서 환원제에 면역이 된다. 단백질에 관해서, 이 분자들 자체가 특정한 입사광 파장을 흡수할 때 형광물질을 방출할 것이다. 이것의 한 예인 녹색 형광 단백질(GFP)은 청색에서 자외선 범위의 빛에 노출되면 녹색으로 형광한다. 형광 단백질은 단백질의 국소화, 단백질 결합 관찰, 유전자 발현 계량화에 도움을 줄 수 있는 우수한 리포터 분자다.[1]

영상 범위

형광의 일부 파장은 인간의 눈의 범위를 벗어나기 때문에, 빛을 정확하게 감지하고 배출을 이미지화하기 위해 충전 결합 장치(CCD)를 사용한다. 이는 일반적으로 300~800nm 범위에서 발생한다. 형광 신호의 장점 중 하나는 방출되는 빛의 강도가 제공된 형광 분자의 양과 관련하여 다소 선형적으로 작용한다는 것이다. 이것은 분명히 흡수된 빛의 세기와 파장이 일정하다는 조건이다. 실제 이미지 자체로 볼 때 보통 12비트 또는 16비트 데이터 형식으로 되어 있다.[1]

실험용 마우스 3개에서 자외선에 노출되는 녹색 형광 단백질(GFP)

영상 시스템

형광 영상 시스템의 주요 구성 요소는 다음과 같다.

  • 흥분 소스: UV 빛과 같은 넓은 파장 소스 또는 레이저와 같은 좁은 파장 소스 중 하나를 생산하는 장치.
  • 조명 디스플레이 광학: 빛이 샘플을 비추는 메커니즘. 이것은 일반적으로 샘플의 직접 조명을 통해 이루어진다.
  • 광구획 광학: 빛 자체의 채집 방법. 이것은 일반적으로 렌즈, 거울, 필터를 구성한다.
  • 방출된 빛의 여과: 광학 필터는 반사된 빛과 산란된 빛이 형광에 포함되지 않도록 한다. 배출 필터의 세 등급은 롱패스, 쇼트패스, 밴드패스다.
  • 검출, 증폭 및 시각화: 방출된 광자를 검출하고 정량화하기 위해 광전자 증배기(PMT) 또는 충전 커플 장치(CCD)를 사용한다.

적용들

  • PCR(agarose gel electrophorisis): SYBR Green은 DNA와 결합하는 매우 흔한 염료로, 아가로오스 젤에서 DNA 띠를 시각화하는 데 사용된다. 이 염료는 푸른 빛을 흡수하고, 영상 시스템이 포착할 수 있도록 초록색을 형광한다.
  • 블로팅(서양, 북방, 남방): 형광 색소는 항체, RNA, DNA와 결합하여 데이터를 형광 및 정량화할 수 있다.
  • DNA 염기서열 분석: 생거 염기서열 분석은 형광 표시 ddNTPs를 형광 표시로 형광 표시로 형광 표시로 형광 표시로 형광 표시로 형광 표시 ddNTP를 사용할 수 있는 핵산 검출의 일반적인 형태다.
  • 형광 투시 영상 유도 수술: 형광학적으로 항법 수술에 도움이 되도록 질량에 라벨을 붙이는 의료 영상 접근법이다. 예를 들어 인도시아닌 그린은 암 환자의 림프절을 검출하는 데 사용될 수 있다.[4]
  • 1나노미터 정확도(FIONA): 전체 내부 반사 조명을 활용하여 노이즈를 줄이고 플루오포어의 밝기를 증가시킴
  • 칼슘 이미징(Calcium imaging): Ca2+ 이온에 묶였을 때 형광에서 변하는 칼슘 지표라고 불리는 형광 분자를 활용하는 기술이다. 이것은 신경계에서 세포가 활동할 때를 보는 데 있어 중요한 부분이다.[5]
UV 조명 아래 에티듐브로미드를 형광 태그로 사용한 Agarose 겔

현미경의 종류

이미지의 시각화와 대비를 바꾸기 위해 다른 종류의 현미경 기법을 사용할 수 있다. 각각의 방법은 장단점이 있지만, 모두 생물학적 과정을 관찰하기 위해 형광의 동일한 메커니즘을 이용한다.

  • 총 내부 반사 형광 현미경: 단일 분자의 형광을 선택적으로 관찰하기 위해 반사파를 사용하는 현미경 기법이다.[6]
  • 라이트 시트 형광 현미경: 검체의 얇은 조각을 수직으로 검사하는 형광 현미경 기법.[7]
  • 형광 투시 평생 이미지 현미경: 시간 경과에 따른 형광 변화를 기록하는 영상 기술

이점

  • 비침습성: 피부에 구멍을 낼 필요 없이 체내 영상 촬영 가능
  • 민감: 탐침은 DNA, RNA, 단백질과 같은 생물학적 분자를 검출하는 데 매우 민감하도록 설계된다.[1]
  • 다중 라벨링: 샘플 내에서 여러 개의 형광 색소가 검출되어 표준과 제어 장치를 쉽게 통합할 수 있다.
  • 라벨이 부착된 분자의 안정성: 이미징에 사용되는 형광 표시된 분자는 몇 달 동안 보관할 수 있지만, 방사선으로 포장된 분자와 같은 다른 분자는 며칠 동안 부패한다.[7]
  • 취급하기에 비교적 안전함: 대부분의 플루오르포르는 장갑으로 안전하고 충분히 취급할 수 있는 반면, 예를 들어 방사성 동위원소는 납 실드 또는 기타 방사선 방호가 필요할 수 있다.[7]
  • 단순처리 : 많은 불소포자가 최소한의 처리방법을 요구하는 반면 방사성폐기물은 규제된 처리와 장기처리가 필요하다. 이것은 또한 이러한 제품들을 활용하는데 필요한 비용을 낮추는 데 도움이 된다.

단점들

이미지 캡처를 위한 충전식 결합 장치(CCD)가 있는 형광 현미경의 예
  • 사진블레이싱: 지면 상태와 흥분 상태 사이의 지속적인 순환이 분자를 손상시키고 그 강도를 감소시키는 불소포레에 널리 퍼져 있는 문제.[7]
  • 환경 민감성: 온도, 이온 농도, pH와 같은 환경적 요인이 형광색소의 효율과 배출에 영향을 미칠 수 있음
  • 독성: 아오메 플루오로크롬은 세포, 조직, 생체내 또는 돌연변이를 생성하여 독성을 가질 수 있다.[8]
  • 제한된 해결 능력: 형광 현미경은 거시적 수준에서 가까운 물체를 구별하는 능력이 제한된다. 이에 비해, 예를 들어 전자현미경은 훨씬 더 작은 범위에서 해결할 수 있는 능력이 있다.
  • 제한된 초기 광도 범위: 입사 광원 강도는 한계가 있으며 이 지점을 넘어서면 분자의 광도 파괴를 초래할 수 있다.[1]

전반적으로, 이러한 형태의 영상은 생물학적 과정을 감시할 수 있는 능력과 함께 최첨단 연구에 매우 유용하다. 2D 형광 이미지에서 3D 형광 이미지로의 발전은 과학자들이 공간 정밀도와 해상도를 더 잘 연구할 수 있게 했다. 게다가, 4D 분석을 위한 집중적인 노력으로, 과학자들은 이제 실시간으로 세포들을 감시할 수 있게 되었고, 빠른 연기 과정을 감시할 수 있게 되었다.

미래 방향

형광 단백질 범위에 따른 형광 색상의 변화

보다 효과적인 형광 단백질을 개발하는 것은 많은 과학자들이 영상 탐사선 능력을 향상시키기 위해 취한 과제다. 종종 특정 잔류물의 돌연변이는 단백질의 형광 특성을 크게 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 해파리 GFP에서 F64L 유전자를 변형시킴으로써, 단백질은 실험실에서 배양균을 배양할 때 가져야 할 중요한 속성인 37°C에서 보다 효율적으로 형광물질을 투과할 수 있다.[9] 이 외에도 유전공학은 더 좋은 파장이나 주파수로 빛을 방출하는 단백질을 생산할 수 있다.[9] 또 환경 자체가 결정적인 역할을 할 수 있다. 형광 수명은 극지 환경에서 안정될 수 있다.

잘 설명되었지만 실제 적용에 반드시 포함되지는 않은 메커니즘은 형광 이미징에 대한 유망한 잠재력을 가지고 있다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 1~10nm의 범위에서 신호 분자를 생성하는 극도로 민감한 메커니즘이다.[6]

형광 프로세스를 구성하는 기법의 개선은 보다 효율적인 설계에도 중요하다. 형광 상관 분광법(FCS)은 형광 강도의 변동을 관찰하는 분석 기법이다. 이 분석은 많은 형광 이미지 기계의 구성요소로서 공간 해상도의 향상은 감도와 범위를 개선할 수 있다.[6]

레이저 유도 형광에 대한 보다 민감한 프로브와 분석 기법의 개발은 보다 정확하고 최신의 실험 데이터를 가능하게 할 수 있다.

참고 항목

참조

  1. ^ a b c d e f "Fluorescence Imaging Principles and Methods" (PDF). Boston University. December 2012.
  2. ^ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019-05-17). "Enhanced in vivo Optical Imaging of the Inflammatory Response to Acute Liver Injury in C57BL/6 Mice Using a Highly Bright Near-Infrared BODIPY Dye". ChemMedChem. 14 (10): 995–999. doi:10.1002/cmdc.201900181. ISSN 1860-7179. PMID 30920173. S2CID 85544665.
  3. ^ "Fluorescence imaging—Latest research and news". Nature. Retrieved 2019-04-18.
  4. ^ Nagaya, Tadanobu; Nakamura, Yu A.; Choyke, Peter L.; Kobayashi, Hisataka (2017-12-22). "Fluorescence-Guided Surgery". Frontiers in Oncology. 7: 314. doi:10.3389/fonc.2017.00314. ISSN 2234-943X. PMC 5743791. PMID 29312886.
  5. ^ "Fluorescence microscopy—pros and cons". DNA Learning Center. Retrieved 2019-04-18.
  6. ^ a b c Haustein, Elke; Schwille, Petra (September 2007). "Trends in fluorescence imaging and related techniques to unravel biological information". HFSP Journal. 1 (3): 169–180. doi:10.2976/1.2778852. ISSN 1955-2068. PMC 2640989. PMID 19404444.
  7. ^ a b c d Forero-Shelton, Manu (April 2019). "Peering into cells at high resolution just got easier". Nature Methods. 16 (4): 293–294. doi:10.1038/s41592-019-0373-3. ISSN 1548-7105. PMID 30886415. S2CID 81982416.
  8. ^ Alford, Raphael; Simpson, Haley M.; Duberman, Josh; Hill, G. Craig; Ogawa, Mikako; Regino, Celeste; Kobayashi, Hisataka; Choyke, Peter L. (2009-11-01). "Toxicity of Organic Fluorophores Used in Molecular Imaging: Literature Review". Molecular Imaging. 8 (6): 7290.2009.00031. doi:10.2310/7290.2009.00031. ISSN 1536-0121.
  9. ^ a b Piston, David W.; Davidson, Michael W.; Cranfill, Paula J.; Gilbert, Sarah G.; Kremers, Gert-Jan (2011-01-15). "Fluorescent proteins at a glance". J Cell Sci. 124 (2): 157–160. doi:10.1242/jcs.072744. ISSN 0021-9533. PMC 3037093. PMID 21187342.

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