간섭 반사 현미경

간섭 반사 현미경(IRM)은 편광 빛을 활용해 유리 표면에 물체의 이미지를 형성하는 광학 현미경 기법이다.신호의 강도는 물체와 유리 표면의 근접도를 측정한다.이 기법은 TIRF 현미경과는 대조적으로 (형광) 라벨을 사용하지 않고 세포막에서 사건을 연구하는데 사용될 수 있다.

역사

이 방법은 처음에 기름의 박막을 연구하는 데 사용되었다.^[1][2]1964년, 세포 생물학에서 이 기술의 첫 적용은 커티스에 의해 배아 병아리 심장 섬유증을 연구하기 위해 도입되었다.^[3]그는 유리와의 접촉이 대부분 세포 주변과 가성질에 한정되어 있다는 점에 주목하면서 IRM을 이용해 접착 부위와 섬유블라스트 거리를 살펴보았다.^[3]

이 기술은 정교하게 다듬어져 나중에 70~80년대 여러 연구자들에 의해 기술의 질적, 정량적 측면들이 설명되었다:^[4] 베리에테-한과 그의 동료들은 서로 다른 포유류 세포 라인이 특정 초점 접착 부위에서 유리 기질에 달라붙는다는 것을 보여주면서 이 기술을 전자 현미경 검사와 상관시켰다.^[5]

이론

부착된 세포의 이미지를 형성하기 위해 특정 파장의 빛이 편광기를 통해 전달된다.이 선형 편광은 목표물을 향해 빔 스플리터에 의해 반사되며, 이는 시료에 빛을 집중시킨다.유리 표면은 일정 정도 반사되어 편광 빛을 반사한다.유리에 반사되지 않는 빛은 세포 안으로 이동하며 세포막에 반사된다.세 가지 상황이 발생할 수 있다.첫째, 막이 유리에 가까우면 유리에서 반사된 빛이 파장의 절반으로 이동하므로, 막에서 반사된 빛이 유리상으로부터 반사된 빛에 비해 위상 편이 되어 서로 상쇄(간섭)하게 된다.이 간섭으로 인해 최종 영상(그림의 왼쪽 케이스)에 어두운 픽셀이 발생한다.둘째, 막이 유리에 부착되지 않았을 때, 막에서 반사되는 빛은 유리에서 반사되는 빛에 비해 위상 편차가 작기 때문에 서로 상쇄되지 않아 영상에서 밝은 픽셀(그림의 오른쪽 케이스)이 나타난다.셋째, 시료가 없을 때는 유리에서 반사된 빛만 검출되어 최종 영상에서 밝은 픽셀로 나타난다.

반사된 빛은 빔 스플리터로 다시 이동하며 산란된 빛을 제거하는 두 번째 편광기를 통과한 뒤 최종 그림을 그리기 위해 검출기(보통 CCD 카메라)에 도달한다.편광기는 산란 광선을 줄임으로써 효율을 높일 수 있지만, 민감한 디지털 카메라를 가진 현대적인 환경에서는 필요 없다.^[6]

이론

반사는 굴절 지수의 변화에 의해 발생하기 때문에 모든 경계에서 빛의 일부가 반사될 것이다.반사량은 다음 규칙에 따라 반사 계수 $r{\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle {12}_{}}$ $displaystyle r_{12}\!}$에 의해 주어진다$.$^[4]

${\displaystyle r_{12}={\frac {n_{1}-n_{2}}:{n_{1}+n_{2}}}}}$

반사율 $R{\displaystyle }$ ${\$은(는) 반사광 강도(${\displaystyle I_{}}$ r $displaystyle I_{r$와 들어오는 ${\displaystyle {}_{}({}_{}}{\displaystyle I_{}}$ {\$displaystyle I_{$i}\}!})의 비율이다.$$^[4]

${\displaystyle R={\frac {I_{r}}{{r}}{{\displaystyI_{i}}=\왼쪽\lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}:{n_{1}+n_{2}}}}\오른쪽\rbrack ^{2}={r_{12}^{2}}$

유리(1.50-1.54, 목록 참조), 물(1.31, 목록 참조), 세포막(1.48)^[7] 및 세포솔(1.35)에 대한 일반적인 굴절 지수를 사용하여 각 인터페이스에 반사되는 빛의 비율을 계산할 수 있다.^[7]굴절률의 차이가 커짐에 따라 반사량이 증가하여 유리 표면과 배지(물 약 1.31-1.33)의 인터페이스에서 큰 반사가 일어난다.이것은 셀이 없으면 이미지가 밝을 것이라는 것을 의미하는데, 셀이 부착되었을 때, 중간과 막의 차이는 위상에서 약간 이동되는 큰 반사를 일으켜 유리에 반사된 빛과 간섭을 일으킨다.중간-메브레인 인터페이스에서 반사되는 빛의 진폭이 산란으로 인해 감소하기 때문에 부착된 부위는 더 어둡지만 완전히 검지는 않게 나타날 것이다.표본에 초점을 맞춘 빛의 원뿔은 입사광의 다른 각도를 발생시키기 때문에 광범위한 간섭 패턴이 존재한다.패턴이 1파장(제로오더 프린지) 미만으로 차이가 나면 패턴이 수렴해 강도가 높아진다.이는 숫자 간격이 1보다 큰 목표를 사용하여 얻을 수 있다.^[4]

요구 사항들

IRM을 이용해 셀을 영상화하려면 현미경에는 적어도 다음과 같은 요소가 필요하다 1) 할로겐 램프와 같은 광원, 2) 광학 필터(소규모의 파장을 통과하는 광학 필터), 3) 빔 스플리터(선택한 파장의 50%를 반사하고 50%를 전송하는 광원)가 필요하다.

광원은 빔 스플리터와 샘플 자체에 의해 많은 빛이 손실되기 때문에 고강도의 빛을 생성해야 한다.파장마다 IRM 이미지가 다르다; Bereiter-Han과 동료들은 그들의 PtK 2 세포의 경우 파장 546 nm의 빛이 파장 436 nm의 푸른 빛보다 더 나은 대비를 이루었다는 것을 보여주었다.^[5]IRM의 기본이론에 대해서는 많은 정밀한 개선이 이루어졌는데, 그 대부분이 이미지 형성의 효율성과 수율을 높인다.빔 스플리터와 시료 사이에 편광기와 4분의 1파판을 배치하면 선형 편광광을 원형 편광으로 변환한 뒤 다시 선형 편광으로 변환해 시스템의 효율을 높일 수 있다.원형 편광기 기사는 이 과정을 상세히 논한다.또한 첫 번째 편광기에 비해 90° 회전하는 두 번째 편광기를 포함하면 표유등이 검출기에 도달하는 것을 방지하여 신호 대 잡음 비를 증가시킬 수 있다(Verschueren의^[4] 그림 2 참조).

생물학적 응용

생물학적 샘플을 연구하기 위해 IRM을 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다.세포 접착과^[3] 세포 이동에 초점을 맞춘 이 기술의 초기 사용 사례.^[8]

베시클 핵융합

더 최근에, 이 기술은 크로마핀 세포의 난포증을 연구하기 위해 사용되었다.^[6]DIC를 이용해 영상을 촬영하면, 크로마핀 세포는 작은 돌기가 있는 둥근 세포로 나타난다.IRM을 이용해 같은 셀을 영상화하면 유리 위에 놓인 셀의 발자국은 작은 돌기가 있는 어두운 영역으로 뚜렷이 볼 수 있다.베실체가 막과 융합하면 어두운 발자국(오른쪽 패널의 상단 셀의 밝은 부분) 안에서 작은 빛 원으로 나타난다.

IRM을 이용한 크로마핀 세포의 베시클 융합의 예가 영화 1에 나와 있다.60 mM 칼륨으로 자극을 받으면 촘촘한 노심 과립의 외반증(exocytosis) 결과 크로마핀 세포의 어두운 발자국 안쪽에 여러 개의 밝은 반점이 나타나기 시작한다.IRM은 형광 라벨을 필요로 하지 않기 때문에 에피플루오렌스, TIRF 현미경 등 다른 영상 기법과 결합해 소두막 외세포증, 내포증과 함께 단백질 역학을 연구할 수 있다.형광 라벨이 없는 또 다른 이점은 광독성을 감소시킨다는 것이다.

참조

추가 읽기

• Soft Matter and Cell 부착력의 정량적 반사 간섭현미경(RICM), Laurent Limozin and Kheya Sengupta, ChemPhysChem 2009, 10, 2752 – 2768

외부 링크

• 알버트 아인슈타인 IRM 의과대학
• 니콘 현미경 반사현미경u