현장유동분율

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FFF(Field-flow fraction)는 Prof에 의해 발명된 분리 기술입니다.^[1]J. 캘빈 기딩스.이 기술은 액체 용액 내의 콜로이드성 또는 고분자량 물질의 분리를 기반으로 하며, 정지 상을 갖지 않는 분리 플랫폼을 통해 흐릅니다.이것은 액체 크로마토그래피와 유사한데, 이것은 흐르는 용출액에 의해 운반되는 묽은 용액 또는 용질의 현탁액에서 작동하기 때문입니다.분리는 길고 좁은 층류 채널을 통해 펌핑되는 샘플의 이송 방향에 수직인 장(유압, 원심,^[2] 열,^[3] 전기,^[4] 자기,^[5] 중력 등) 또는 교차 흐름을 적용함으로써 달성됩니다.필드는 샘플 구성 요소에 힘을 가하여 채널 벽 중 하나로 집중시킵니다. 이를 누적 벽이라고 합니다.^[6]힘은 표본의 속성과 상호작용하여 분리가 발생합니다. 즉, 성분들은 교차장에 의해 작용하는 힘 아래에서 다른 "이동성"을 보여줍니다.예를 들어, 유압식, 또는 교차 흐름 FFF 방식의 경우, 특성 구동 분리는 병진 확산 계수 또는 유체역학적 크기입니다.열장(한 벽을 가열하고 다른 벽을 냉각)의 경우 열과 병진 확산 계수의 비율입니다.

응용프로그램 및 검출방법

FFF는 "정상" 모드에서 서브-마이크론 범위(1 nm에서 수 마이크론까지) 또는 소위 입체^[7][8] 모드에서 최대 50 마이크론까지 적용할 수 있습니다.정상 모드에서 입체 모드로의 전환은 마이크론 이상의 크기에서 확산이 무시될 수 있을 때 발생합니다.FFF는 한 분석에서 분리할 수 있는 용해성 고분자와^[9] 입자 또는 콜로이드 모두를 포괄하는 광범위한 동적 크기 범위에서 독특합니다.

전형적인 응용은 높은 몰 질량 폴리머 및 폴리머 복합재, 나노 입자, 산업 및 환경, 바이러스 및 바이러스(예를 들어 입자, 지질 나노 입자, 세포 외 소포 및 기타 유형의 생물학적 샘플입니다.

FFF는 HPLC 또는 SEC에서 알려진 모든 유형의 검출기에 연결할 수 있습니다.FFF가 액체 크로마토그래피와 유사하기 때문에 채널을 통과하는 액체 이동상의 방식에서 가장 일반적인 검출기는 LC에도 사용되는 검출기입니다.가장 자주 사용되는 것은 UV-VIS 검출기인데, 이는 비파괴적인 특성 때문입니다.다중 각도 광 산란과 결합하면 용출 분율의 크기를 계산하고 FFF 이론을 통해 얻은 값과 비교할 수 있습니다.또 다른 인기 있는 특정 검출은 금속 나노입자를 높은 특이성과 민감도로 특성화하기 위한 유도 결합 플라즈마 질량 분석입니다.

이점

FFF는 복잡하고 비균질한 샘플의 물리적 분리를 제공하며, 이는 크기 제외 크로마토그래피와 같은 다른 분리 방법으로 특징 지을 수 없습니다.정지상이 없기 때문에 표면 또는 기둥 패킹 재료와의 상호 작용이 적습니다.분리장의 강도를 조절하여 분리를 조정할 수 있습니다.FFF는 부드러운 방법으로 깨지기 쉬운 시료에 물리적인 스트레스를 주지 않으며, 최상의 시료 안정성을 고려하여 캐리어 용액을 조정할 수 있습니다.FFF는 일련의 시행착오 실험 없이 최적의 결과에 도달하기 위한 분리 조건을 찾는 데 사용할 수 있는 잘 해결된 이론을 가지고 있습니다.또한 FFF 이론에서 샘플 분율의 물리적 매개변수 정보를 추출할 수도 있지만, 거의 모든 사용자는 대부분 광산란 검출기에 의존하여 샘플 분율의 크기를 측정합니다.

한계

FFF는 빠른 확산 때문에 작은 분자에는 작동하지 않습니다.효과적인 분리를 위해서는 시료를 축적벽(10 µm 미만의 거리)에 매우 가깝게 농축해야 하며, 이를 위해서는 힘장에 의한 표류 속도가 확산 계수에 비해 2배 이상 높아야 합니다.FFF 채널에서 생성될 수 있는 최대 필드 강도에 따라 분리의 낮은 크기 범위가 결정됩니다.현재 계측기의 경우 이 값은 약 1 nm입니다.

FFF는 매우 다재다능한 기술이지만, 모든 애플리케이션에 "하나의 크기로 모든 것을 맞출 수 있는" 방법은 없습니다.다양한 FFF 방법에는 전문적인 계측기가 필요합니다.현재는 소위 비대칭 유동장-유동 분획(AF4)^[10]만이 널리 사용되고 있습니다.원심력, 열 또는 전기적 FFF와 같은 다른 방법은 여전히 틈새 시장이 존재합니다.

FFF는 컬럼 크로마토그래피와 다르게 동작하며 HPLC 또는 SEC 사용자에게 반직관적일 수 있습니다.이 방법을 성공적으로 적용하기 위해서는 FFF의 작동 원리를 이해하는 것이 중요합니다.

발견 및 일반원칙

FFF는 1966년과^[11] 1976년에 J. 캘빈 기딩스(J. Calvin Giddings)에 의해 고안되고 처음 출판되었습니다.^[1]Giddings는 오늘날 가장 중요한 FFF 기법인 Flow-FFF에^[12] 대한 많은 기사를 발표했습니다.FFF의 발명으로 인정받은 기딩스는 유타 대학교의 화학과 교수이자 크로마토그래피와 분리 기술의 전문가였습니다.

위에서 언급한 바와 같이, 필드 흐름 분획에서 필드는 유압식(축적벽으로서 반투과성 멤브레인을 통한 교차 흐름), 중력식, 원심식, 열식, 전기식 또는 자기식일 수 있습니다.모든 경우에, 분리 메커니즘은 확산력과 정적 평형 상태에서 장의 힘 아래에서 입자 이동성의 차이에 의해 생성됩니다.필드는 축적 벽을 향해 하향 드리프트 속도와 농도를 유도하고 확산은 이 농도 구배에 대해 작용합니다.일정 시간이 지나면(이완 시간이라고 함) 두 힘은 정지 평형 상태에서 평형을 이룹니다.이는 입자 구름으로 가장 잘 시각화되며, 모든 구성 요소가 일정한 운동을 하지만 평균 농도가 기하급수적으로 감소하여 축적 벽에서 채널로 이동합니다.해수면에서 상승하는 기압의 감소는 기압 공식에서 설명되는 지수적 감소와 같습니다.이완이 이루어지면 채널 흐름이 활성화되면서 용출이 시작됩니다.얇은 채널(일반적인 높이 250 ~ 350 µm)에는 포물선 층류-흐름-속도 프로파일이 존재하며, 이는 축적벽으로부터 거리가 증가함에 따라 유속이 강하게 증가하는 것을 특징으로 합니다.이것은 채널의 벽으로부터 평형 위치를 기준으로 특정 입자의 속도를 결정합니다.축적 벽에 가까운 입자는 다른 입자보다 높은 곳에 비해 느리게 이동합니다.입자 종의 속도와 유체의 평균 속도의 비율을 유지비 R이라고 합니다.효율적인 분리를 위해 FFF에서 R은 0.2 미만이어야 하며, 일반적인 값은 0.02~0.1 범위입니다.

이론과 방법

필드 흐름 분획에서의 분리는 층류 채널에서 발생합니다.상단 블록과 하단 블록이 스페이서로 분리되어 구성되어 있습니다.스페이서에는 컷아웃(직각형 또는 사다리꼴) 공극이 있으며, 이 공극은 스페이서가 블록 사이에서 밀봉될 때 채널 부피를 생성합니다.또는 채널을 캐비티로서 상단 블록에 밀링할 수도 있습니다.채널은 힘 필드를 적용할 수 있도록 설계되어 있으며, 이는 각 FFF 방법에 대해 전용 채널이 필요함을 의미합니다.샘플은 희석 용액 또는 현탁액으로 채널 내로 주입되며 캐리어 용액이 채널을 통해 펌핑됨에 따라 입구에서 출구로 이동하는 동안 분리됩니다.채널 출구의 하류에는 용출 분율을 분석하는 하나 또는 여러 개의 검출기가 배치되어 있습니다.

Giddings와 동료들은 모든 FFF 방법에 공통적인 일반적인 유지 방정식을 설명하는 이론을 개발했습니다.

유지 시간(t_r)과 힘(F)의 관계

분리력장과 유지시간의 관계는 첫 번째 원리에서 도출할 수 있습니다.FFF 채널 내의 두 입자 모집단을 고려합니다.크로스 필드는 양쪽 입자 구름을 아래쪽 "누적" 벽 쪽으로 몰고 갑니다.이 힘의 장에 반대되는 것은 입자의 자연 확산, 즉 브라운 운동으로 역작용 운동을 만듭니다.이 두 수송 과정이 평형에 도달할 때 입자 농도 c는 식 (1)과 같이 축적 벽 위의 고도 x의 지수 함수에 접근합니다.

${\displaystyle c=c_{0}e^{\frac {-x}{\ell}}}$

(1)

${\displaystyle }${\$displaystyle \ell$}은$($는) 입자 구름의 특성 표고를 나타냅니다.이는 채널 내에서 입자 구름이 도달하는 평균 높이와 관련되며, 입자 모집단 분리에 대해 ℓ$${\$displaystyle \ell}$에 대한 값이 다를 경우에만 발생합니다.각 구성 요소의 ℓ ${\displaystyle \ell}$은(는) 각 개별 입자에 가해지는 힘과 관련되거나 확산 계수 D와 표류 속도 U의 비율과 관련될 수 있습니다.

${\displaystyle \ell = {\frac {kT}{F}}= {\frac {D}{U}}}$

(2)

k는 볼츠만 상수, T는 절대 온도, F는 힘장에 의해 단일 입자에 작용하는 힘입니다.이것은 특성 표고 값이 적용된 힘에 어떻게 반비례하는지 보여줍니다.따라서 F가 분리 과정을 지배합니다.따라서 현장 강도를 달리함으로써 최적의 수준을 달성할 수 있도록 분리를 제어할 수 있습니다.

분자 구름의 속도 V는 단순히 포물선 흐름 프로파일에 포함된 지수 분포의 평균 속도입니다.

보존 시간, t는_r 다음과 같이 쓸 수 있습니다.

${\displaystyle t_{r}={\frac {L}{V}}$

(3)

여기서 L은 채널 길이입니다.

FFF에서 유지는 일반적으로 유지 시간 t로_r 나눈 void time₀ t(비유지 트레이서의 출현)인 유지 비율로 표시됩니다.그러면 보존 방정식은 다음과 같습니다.

${\displaystyle R={\frac {t_{0}}{t_{r}}=6\lambda [\operatorname {coth}({\frac {1}{2\lambda }})]-2\lambda]}$

(4)

여기서 λ ${\displaystyle$\lambda }은(는) 채널 두께 또는$$높이를 w로 $나눈$ ℓ ${\$displaystyle \$ell}$입니다.ℓ ${\displaystyle$ \ell}$대신$kT/F를 대입하면 가해진 교차력에 대한 유지 비율이 표시됩니다.

${\displaystyle R=6{\frac {kT}{Fw}}[\coth({\frac {Fw}{2kT})]-2{\frac {kT}{Fw}]}$

(5)

효율적인 작업을 위해 채널 두께 값 w는 ℓ ${\displaystyle \ell}$을(를) 훨씬 초과합니다$.$ 이 경우 괄호 안의 항이 통일에 가까워집니다.따라서 식 5는 다음과 같이 근사할 수 있습니다.

${\displaystyle R=6\lambda =6{\frac {kT}{Fw}}$

(6)

따라서_r F에 대략적으로 비례합니다.입자 밴드 X와 Y의 분리는 그들 사이의 힘 증가 ∆F)가 충분할 경우에만 달성됩니다.이 경우 10N의⁻¹⁶ 차동 장치가 필요합니다.

F와 ∆F의 크기는 입자 특성, 전계 강도 및 전계 유형에 따라 달라집니다.이를 통해 기술의 변형과 적응이 가능합니다.이 기본 원리로부터 많은 형태의 FFF는 적용되는 분리력의 특성과 그들이 목표로 하는 분자 크기의 범위에 따라 다양하게 진화했습니다.

프랙토그램

FFF에서 검출기 신호를 시간의 함수로 표시하는 것은 컬럼 크로마토그래피 기법의 크로마토그램과는 대조적으로 프랙토그램이라고 합니다.FFF 이론 및/또는 디텍터 신호를 사용하여 프랙토그램을 분석 물질의 하나 또는 여러 물리적 특성의 분포도로 변환할 수 있습니다.이것은 크기, 어금니 질량, 전하 등이 될 수 있습니다.

종종 이 물질들은 처음에 작은 부피의 액체 버퍼에 부유되어 버퍼에 의해 FFF 채널을 따라 밀려나갑니다.특정 입자 종의 다양한 속도는 크기, 질량 및/또는 균일하지 않은 흐름 속도를 가진 채널의 벽과의 거리에 기인할 수 있습니다.따라서 샘플에서 다른 종의 존재는 긴 채널 아래의 어느 정도 거리에서 공통적인 특성을 감지하고 각 종의 도달 시간과 물리적 화학적 특성이 다르기 때문에 피크별로 다양한 종의 존재를 나타내는 결과적인 프랙토그램을 통해 확인할 수 있습니다.

양식

오늘날 사용 가능한 대부분의 기법은 원래 교수가 만든 기법에 대한 진보입니다.거의 40년 전의 기드닝.

대칭흐름

이러한 기술 중 FFF 흐름은 상업적으로 처음 제공되었습니다.Flow FFF는 밀도에 관계없이 크기에 따라 입자를 분리하며 1 nm~1 µm 범위의 고분자를 측정할 수 있습니다.이 점에서 가장 다재다능한 FFF 하위 기술입니다.Flow FFF의 교차 흐름은 채널 상단의 다공성 프릿을 통해 들어가 축적 벽(즉, 바닥 벽)의 반투과성 막 출구 프릿을 통해 빠져나갑니다.지난 20년 동안 대칭적 흐름은 비대칭적 흐름으로 대체되었습니다.

중공섬유류

Lee 등(1974)은 중공 섬유 흐름 FFF(Hollow Fiber Flow FFF)를 개발하였다.^[14]HF5는 단백질과 다른 거대분자의 분석에 적용되어 왔습니다.HF5는 1974년에 개발된 최초의 유동 FFF 형태였습니다.HF5는 일상적인 용도에서 쉽게 교체할 수 있는 일회용 채널 장치를 제공한다는 장점이 있습니다.HF5의 단점 중 하나는 막 재료의 선택이 제한적이라는 것입니다. 오직 폴리에테르 술폰(PES) 막만 이용 가능합니다.현재 HF5는 유연성이 부족하고 샘플 부하의 한계가 있기 때문에 널리 사용되지 않습니다.

비대칭 흐름

반면에, 비대칭 흐름 FFF(AF4)는 채널의 바닥 벽에 하나의 반투과성 멤브레인만을 가지고 있습니다.따라서 교차 흐름은 반송파 액체가 채널의 바닥에서 빠져나가는 것에 의해 생성됩니다.이는 매우 부드러운 분리와 "초광역" 분리 범위를 제공합니다.사용 중인 대부분의 FFF 기기는 AF4 시스템입니다.주요 응용 분야는 단백질, 바이러스 및 바이러스 유사 입자 및 리포좀에 대한 제약 연구 개발입니다.AF4는 수성 용매 및 유기 용매에 적용될 수 있으므로, 유기 폴리머 또한 이 기술에 의해 분리될 수 있습니다.

고온 비대칭 유동장-유동 분획법은 150C 이상의 온도에서 용해 가능한 고온 및 초고 몰 질량 폴리머를 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

보온성

열 FFF는 이름에서 알 수 있듯이 채널에 온도 구배를 적용하여 분리력을 형성합니다.상부 채널 벽은 가열되고 하부 벽은 냉각되어 열 확산에 의해 폴리머 및 파티클을 냉벽 쪽으로 구동합니다.유기용매에서 합성 고분자를 분리하기 위한 기술로서 열적 FFF가 개발되었습니다.열적 FFF는 몰 질량과 화학적 조성에 의해 고분자를 분리할 수 있어 동일한 분자량의 고분자 분획을 분리할 수 있다는 점에서 FFF 기술 중에서 독특합니다.오늘날 이 기술은 폴리머, 겔 및 나노입자의 특성을 파악하는 데 이상적으로 적합합니다.

Thermal FFF의 주요 장점 중 하나는 분리 채널의 단순하고 매우 잘 정의된 치수입니다. 이는 Thermal FFF 보정 상수가 열 확산 계수(또는 열 확산 계수)에 대한 보통(분자) 확산 계수(D)의 비율을 밀접하게 묘사하기 때문에 실험실 간 또는 기기 간 보편적 교정을 가능하게 합니다., 열수성 이동성) D는_T 고분자에만 의존적입니다.따라서 ThFFF 유니버셜 캘리브레이션은 기기와 실험실을 옮길 수 있는 반면, 잘 알려진 크기 제외 크로마토그래피 유니버셜 캘리브레이션은 같은 기기에서만 고분자로 옮길 수 있습니다.^[15]

스플릿 플로우 신셀 분획

SPLITT(Split flow thin-cell fraction)는 중력 또는 전기 또는 µm 크기 이상의 입자를 연속적으로 분리하기 위한 확산 차이를 사용하는 특별한 준비 FFF 기술입니다.SPLITT 시스템에는 두 개의 입구와 두 개의 출구가 있습니다.이 작업은 채널 시작 시 액체에 잠긴 시료를 낮은 유속으로 한 입구로 펌핑하는 동시에 캐리어 액체를 훨씬 높은 유속으로 두 번째 입구로 펌핑하는 방식으로 수행됩니다.두 개의 유입 스트림과 두 개의 유출 스트림의 유량비를 조절함으로써 분리를 조절할 수 있고, 샘플 구성요소는 두 개의 서로 다른 크기의 분수로 분리됩니다.중력을 분리력으로 사용하는 것만으로도 SPLITT는 1 µm 이상의 입자로 제한되는 가장 민감하지 않은 FFF 기술입니다.

원심력

원심 FFF에서 분리장은 원심력을 통해 생성됩니다.이 채널은 링의 형태를 취하는데, 링은 회전 속도로 회전하며, 이는 주행 중에 프로그래밍할 수 있습니다.흐름과 샘플은 채널로 펌핑되고 원심 분리되어 작업자가 질량(크기 및 밀도)으로 입자를 분해할 수 있습니다.원심형 FFF의 장점은 입자 크기가 세 번째 동력에 비례하기 때문에 가해지는 힘을 변화시킴으로써 얻을 수 있는 높은 크기의 분해능에 있습니다.

원심 FFF가 제공하는 독특한 장점은 충분한 부력 밀도를 고려할 때 고해상도 기술 능력에서 비롯됩니다.이를 통해 크기 차이가 5%밖에 나지 않는 입자를 분리할 수 있습니다.

원심형 FFF는 입자와 고분자를 입자의 크기만이 아니라 입자의 밀도에 의해 분리할 수 있다는 장점이 있습니다.이 경우, 동일한 크기의 금 및 은 나노입자 2개는 금 및 은 나노입자의 밀도 차이에 따라 2개의 피크로 분리될 수 있으며,

AF4 분리의 경우 질량과 시간의 비율은 1:1입니다.원심 FFF에 밀도의 세 번째 매개 변수를 추가하면 질량과 유사한 비율이 생성됩니다. 즉, 3의 거듭제곱에 대한 시간입니다.이렇게 하면 피크 간의 차이가 크게 나타나고 해상도가 크게 향상됩니다.이는 나노 입자를 포함하는 복합 재료 및 코팅된 폴리머, 즉 크기는 다양하지 않을 수 있지만 밀도는 다양한 입자와 같은 새로운 제품에 특히 유용할 수 있습니다.이러한 방식으로 동일한 크기의 입자 두 개를 밀도가 다를 경우 두 개의 피크로 분리할 수 있습니다.

이 방법의 한계는 표본의 밀도에 따라 달라지는 크기의 하한에 있습니다.구체적으로 생물학적 샘플의 경우, 한계는 직경이 20~50 nm인 순서입니다.

전기

전기 FFF에서는 횡전류(DC)가 인가되어 전기장이 형성됩니다.샘플 성분의 전하에 따라 전기영동 드리프트 속도가 유도되고 브라운 운동으로부터의 확산에 의해 상쇄되므로 분리는 전기영동 이동도와 크기의 비율에 따라 달라집니다.전기적인 FFF의 적용은 제한적이었고 현재는 거의 사용되지 않습니다.다른 수정 사항, 즉 특별한 교류 전류가 인가되는 순환 전기 FFF가 개발되었습니다.전기영동 이동성에 따라 분리할 수 있습니다.또 다른 변화는 전기 비대칭 흐름 FFF(EAF4)이며, 여기서 교차 흐름 필드 외에 전기 필드가 적용됩니다.EAF4는 분해능이 떨어지고 전기 분해 제품과 기포가 채널 유출을 오염시키고 검출기 신호를 손상시키는 순수 전기 FFF의 한계를 극복합니다.^[19]

참고문헌

외부 링크

• Roda, A. (2005). "Toward Multianalyte Immunoassays: A Flow-Assisted, Solid-Phase Format with Chemiluminescence Detection". Clinical Chemistry. 51 (10): 1993–1995. doi:10.1373/clinchem.2005.053108. ISSN 0009-9147. PMID 16299900.