이소전기 초점

Isoelectric focusing
등전 초점화 계획

전기집중(Electrofocusing)이라고도 하는 IEF는 다른 분자의 등전점(pI)의 차이로 다른 분자를 분리하는 기법이다.[1][2] 관심 분자에 대한 전반적인 전하가 주변 pH의 함수라는 점을 활용하는 젤의 단백질에 주로 행해지는 구역전극성(Zone Electroposesis는 관심 분자에 대한 전반적인 전하가 주변 pH의 함수라는 점을 이용한다.

절차

IEF는 고정된 IPG(pH gradient) 겔에 원형 용액을 추가하는 것을 포함한다. IPG는 pH 그라데이션과 공동 폴리머 처리된 아크릴아미드 젤 매트릭스로, 가장 알칼리성(>12) pH 값을 제외하고 완전히 안정된 그라데이션이 발생한다. 고정된 pH 구배는 고정장치 비율의 연속적인 변화에 의해 얻는다. 이모빌린은 그것의 pK 값으로 정의되는 약한 산 또는 염기이다.

등전점(pI) 아래의 pH 영역에 있는 단백질은 양극으로 충전되므로 음극(음극으로 충전된 전극)으로 이동한다. 그러나 pH 증가의 구배를 통해 이동하기 때문에 단백질이 pI에 해당하는 pH 영역에 도달할 때까지 단백질의 전체 전하가 감소한다. 이 시점에서는 순전하가 없으므로 마이그레이션이 중단된다(두 전극 중 하나로 가는 전기적 유인력이 없기 때문이다). 결과적으로, 단백질은 각각의 단백질이 그것의 pI에 해당하는 pH 구배에서 한 지점에 위치하면서 날카로운 고정 밴드에 집중하게 된다. 이 기술은 단일 전하에 의해 다른 단백질을 별도의 띠로 분할하여 극도로 높은 분해능을 발휘할 수 있다.

초점이 맞춰질 분자는 pH 구배(보통 원형극장에 의해 생성됨)가 있는 매체에 분포한다. 전류가 매체를 통과하여 "양" 양극과 "음" 음극 단부를 만든다. 음전하 분자는 매질의 pH 구배를 통해 "양전하" 종단 쪽으로 이동하는 반면 양전하 분자는 "음전" 종단 쪽으로 이동한다. 입자가 전하의 반대쪽 극을 향해 이동할 때, 그것은 변화하는 pH 구배를 통해 이동하며, 그것이 분자 등전점의 pH에 도달하는 지점에 도달할 때까지 이동한다. 이 시점에서 분자는 더 이상 순전하를 갖지 않으며(관련 기능 그룹의 양성 또는 감응으로 인해) 젤 내에서 더 이상 진행되지 않는다. pI 값이 다양한 폴리아홀리테스와 같은 작은 분자의 용액을 먼저 전기영양에 적용하여 관심 입자를 추가하기 전에 구배선을 설정한다.

이 방법은 pI로 대표되는 산성 잔류물과 기초 잔류물의 상대적 함량을 바탕으로 분리되는 단백질 연구에 특히 자주 적용된다. 단백질은 pH 그라데이션이 확립된 폴리아크릴라미드, 전분 또는 아가로스로 구성된 이모빌라이제 pH 그라데이션 젤에 유입된다. 이 과정에서 모공이 큰 젤은 크기가 다른 단백질에 대한 이동률이 달라 pI 내 인공물, 또는 "가져가는" 효과를 제거하기 위해 주로 사용된다. 이소전기 포커스는 pI 값이 다른 단백질을 0.01 정도까지 해결할 수 있다.[3] Isoelectric focusing은 2차원 겔 전기영동학의 첫 단계로, 단백질이 처음에는 pI 값에 의해 분리되었다가, 나아가 SDS-PAGE를 통해 분자량으로 분리된다.

살아있는 세포

일부 의견에 따르면,[4][5] 살아있는 진핵 세포는 효소와 반응제의 확산에 의한 대사 반응 속도의 한계를 극복하고 특정 생화학 공정의 비율을 조절하기 위해 내부 단백질에 집중하는 등전기를 수행한다. 특정 대사 경로의 효소를 내부의 구별되고 작은 영역에 집중시킴으로써, 세포는 특정 생화학적 경로의 비율을 몇 가지 정도 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 인산화나 탈인산화에 의한 효소 분자의 등전점(pI)의 수정으로, 세포는 효소의 분자를 내부 다른 부분들 사이에 전달하여 특정 생화학적 과정을 켜거나 끌 수 있다.

마이크로유체칩 기반

마이크로칩 기반 전기영양증은 빠른 단백질 분석, 다른 미세유체 단위 작업과의 간단한 통합, 전체 채널 검출, 니트로셀룰로오스 필름, 더 작은 샘플 크기, 낮은 제작비 등을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 모세관 전기영양증에 대한 유망한 대안이다.

다중접합

더 빠르고 사용하기 쉬운 단백질 분리 도구에 대한 수요가 증가함에 따라 IEF가 솔루션 내 분리로 진화하는 속도가 빨라졌다. 이러한 맥락에서, 빠르고 젤이 없는 IEF 분리를 수행하기 위해 다중접합 IEF 시스템이 개발되었다. 다관절 IEF 시스템은 모세관이 각 혈관을 통과하는 일련의 혈관을 활용한다.[6] 각 용기의 모세관의 일부는 반투과성 막으로 대체된다. 혈관은 서로 다른 pH 값을 갖는 완충용액을 포함하고 있어 모세관 내부에 pH 구배가 효과적으로 설정된다. 각 용기의 완충 용액은 고압 전원 공급기에 연결된 전압 분배기와 전기 접점이 있어 모세관을 따라 전기장을 형성한다. 모세관에 시료(펩타이드나 단백질의 혼합물)를 주입할 때 전기장의 존재와 pH 구배는 등전점에 따라 이러한 분자를 분리한다. 다중접합 IEF 시스템은 생체마커 발견을 위해 알츠하이머병 환자와 2차원 단백질학 및 혈장 단백질을 분리하기 위해 사용되어 왔다.[6]

참조

  1. ^ Bjellqvist, Bengt; Ek, Kristina; Giorgio Righetti, Pier; Gianazza, Elisabetta; Görg, Angelika; Westermeier, Reiner; Postel, Wilhelm (1982). "Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: Principle, methodology and some applications". Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 6 (4): 317–339. doi:10.1016/0165-022X(82)90013-6. ISSN 0165-022X. PMID 7142660.
  2. ^ Pier Giorgio Righetti (1 April 2000). Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Application. Elsevier. ISBN 978-0-08-085880-7.
  3. ^ 스트레이어, 루버트: "바이오케미" 50페이지. Spektrum Akademischer Verlag, 1996년(독일)
  4. ^ Flegr J (1990). "Does a cell perform isoelectric focusing?" (PDF). BioSystems. 24 (2): 127–133. doi:10.1016/0303-2647(90)90005-L. PMID 2249006.
  5. ^ Baskin E.F.; Bukshpan S; Zilberstein G V (2006). "pH-induced intracellular protein transport". Physical Biology. 3 (2): 101–106. doi:10.1088/1478-3975/3/2/002. PMID 16829696.
  6. ^ a b Pirmoradian M.; Astorga-Wells, J., Zubarev, RA. (2015). "Multijunction Capillary Isoelectric Focusing Device Combined with Online Membrane-Assisted Buffer Exchanger Enables Isoelectric Point Fractionation of Intact Human Plasma Proteins for Biomarker Discovery" (PDF). Analytical Chemistry. 87 (23): 11840–11846. doi:10.1021/acs.analchem.5b03344. hdl:10616/44920. PMID 26531800.{{cite journal}}: CS1 maint : 복수이름 : 작성자 목록(링크)
  7. ^ Pirmoradian, M.; Zhang, B.; Chingin, K.; Astorga-Wells, J.; Zubarev R.A. (2014). "Membrane-assisted isoelectric focusing device as a micro-preparative fractionator for two dimensional shotgun proteomics". Analytical Chemistry. 86 (12): 5728–5732. doi:10.1021/ac404180e. PMID 24824042.