크리스퍼 간섭

CRISPR interference
입체 장애를 통한 전사 억제

크리스퍼 간섭(CRISPRi)은 원핵 세포와 진핵 [1]세포에서 유전자 발현의 서열 특이적 억제를 허용하는 유전자 섭동 기술입니다.스탠리 치와 Wendell Lim, Adam Arkin, Jonathan Weissman, Jennifer Doudna의 [2]실험실 동료들에 의해 처음 개발되었습니다.유전자 발현 서열 특이적 활성화는 CRISPR 활성화(CRISPRa)를 말합니다.

이 기술은 박테리아 유전자 면역 시스템 - CRISPR (클러스터된 정기적으로 상호 공간화된 짧은 회문 반복) [3]경로를 기반으로 RNA 간섭에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.그러나 CRISPRi와 RNAi의 차이점은 CRISPRi가 주로 전사 수준에서 유전자 발현을 조절하는 반면 RNAi는 mRNA 수준에서 유전자를 조절한다는 것입니다.

배경

참고 항목: CRISPR 및 CRISPR 유전자 편집

많은 박테리아와 대부분의 고균은 CRISPR RNA (crRNA)와 CRISPR 관련 유전자를 포함하는 적응 면역 체계를 가지고 있습니다.

CRISPR 간섭(CRISPRi) 기법은 Leis S에 의해 처음 보고되었습니다.2013년 [2]초 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스에서 연구원들과 함께 연구를 했습니다.이 기술은 RNA 유도 방식으로 유전자를 조절하기 위해 엔도뉴클레아제 활성이 부족한 촉매로 죽은 Cas9(일반적으로 dCas9로 표시됨) 단백질을 사용합니다.표적 특이성은 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 게놈 위치에 대한 보완적인 염기쌍에 의해 결정됩니다. sgRNA는 키메라 비코딩 RNA로, 20nt 염기쌍 순서, 42nt dCas9 결합 헤어핀 및 40nt 터미네이터 (박테리아,[4] 효모[6],[7] 초파리,[8] 제브라피쉬,[9] 마우스[10])의 세 영역으로 세분화될 수 있습니다.

합성 sgRNA를 설계할 때 20nt 염기쌍 순서만 수정됩니다.또한 2차 변수도 고려해야 합니다. 오프 타겟 효과(기본 페어링 시퀀스의 간단한 BLAST 실행이 필요한 경우), dCas9 결합 헤어핀 구조 유지, 수정된 sgRNA에 제한 부위가 없는지 확인하는 것입니다. 다운스트림 클로닝 단계에서 문제가 발생할 수 있기 때문입니다.sgRNA 설계가 간단하기 때문에, 이 기술은 게놈 전체의 [11]확장에 적용할 수 있습니다.CRISPRi는 촉매 비활성 Cas9의 생성에 의존합니다.이것은 Cas9를 [12]암호화하는 유전자의 2개의 촉매 잔기(D10A 및 H840A)에 점 돌연변이를 도입함으로써 달성됩니다.그렇게 함으로써, dCas9는 dsDNA를 절단할 수는 없지만, DNA를 표적화할 수 있는 능력은 유지합니다.sgRNA와 dCas9는 함께 유전자 특이적 [2]조절을 위한 최소한의 시스템을 구성합니다.

전사규정

압제

CRISPRi는 전사 개시 또는 신장을 차단함으로써 전사를 엄격하게 억제할 수 있습니다.이는 프로모터 또는 엑소닉 서열과 상보적인 sgRNA를 설계함으로써 달성됩니다.코딩 시퀀스 내의 표적에 대한 전사 억제 수준은 가닥별로 다릅니다.CRISPR 이펙터의 특성에 따라 템플릿 스트랜드 또는 템플릿이 아닌 스트랜드가 더 강력한 [13]억제로 이어집니다.dCas9의 경우(Type-2 CRISPR 시스템 기반), 가이드 RNA가 비-템플릿 가닥과 상보적일 때 억제가 더 강합니다.이는 RNA를 풀어주는 헬리케이스(helicase)의 활성 때문인 것으로 제시되고 있습니다.sgRNA가 주형 가닥에 상보적일 때 DNA 헤테로듀플렉스가 RNA pol II보다 앞서 있습니다.전사 신장 블록과 달리, 사일런싱은 전사 시작 부위를 표적으로 할 때 표적 DNA 가닥과 독립적입니다.원핵생물에서, 이 입체 억제는 표적 유전자의 전사를 거의 99.9% 억제할 수 있습니다; 고세균에서, 90% 이상 억제가 달성되었습니다;[14] 인간 세포에서, 최대 90% 억제가 [2]관찰되었습니다.박테리아에서는 충분히 높은 수준의 dCas9 복합체로 표적을 포화시킬 수 있습니다.이 경우 억제 강도는 가이드 [15]서열에 의해 결정되는 RNA 중합효소와의 충돌 시 dCas9가 방출될 확률에만 의존합니다.온도가 높으면 배출 확률이 높아지기 때문에 [15]억제력도 약합니다.진핵생물에서 CRISPRi는 또한 이펙터 도메인을 통해 전사를 억제할 수 있습니다.억제기 도메인을 dCas9에 융합하면 헤테로크로마토그래피화를 유도하여 전사가 더 억제될 수 있습니다.예를 들어, 잘 연구된 KRAB(Krüppel associated box) 도메인은 dCas9에 융합되어 인간 [16]세포에서 대상 유전자의 전사를 99%까지 억제할 수 있습니다.

효율성 향상

촉매 활성 Cas9 뉴클레아제에 의한 유전체 편집은 비가역적인 표적 외 유전체 변형을 동반할 수 있는 반면, CRISPRi는 두 개의 상이한 sgRNA [16]서열에 대한 표적 외 가역 효과를 최소화하면서 매우 특이적입니다.그러나 전사 변조의 효율성을 향상시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되고 있습니다.표적 유전자의 전사 시작 부위를 식별하고 sgRNA의 선호도를 고려하면 표적 [17]부위에 접근 가능한 크로마틴의 존재와 마찬가지로 효율성이 향상됩니다.

기타방법

언급된 다른 개선점들과 함께, 전사 시작으로부터의 거리 및 로컬 크로마틴 상태와 같은 요인들은 활성화/억제 효율을 결정하는데 있어서 중요한 매개변수일 수 있습니다.dCas9 및 sgRNA 발현, 안정성, 핵 국소화 및 상호작용의 최적화는 포유동물 [2]세포에서 CRISPRi 효율의 추가적인 개선을 가능하게 할 것입니다.

적용들

유전자 녹다운

진핵생물에서 유전체의 상당 부분(리포터 및 내인성 유전자 모두)은 렌티바이러스 구조체를 사용하여 dCas9 및 sgRNA를 발현시켜 RNAi 및 TALE [16]단백질과 같은 기존 기술과 유사한 효율로 표적이 될 수 있는 것으로 나타났습니다.CRISPRi는 RNAi와 동일한 응용을 달성하기 위해 함께 또는 자체 시스템으로 사용될 수 있습니다.

박테리아의 경우 CRISPRi에 의한 유전자 녹다운이 완전히 구현되었으며 그람 음성 대장균 및 그람 양성 B. 서브틸리스 [5]모두에 대해 특성화되었습니다.

박테리아뿐만 아니라 고균(예를 들어, M. 아세티보란)에서도 CRISPRi-Cas9는 질소 [14]고정과 관련된 여러 유전자/오페론을 분해하는데 성공적으로 사용되었습니다.

CRISPRi 구축 워크플로우

대립유전자 계열

sgRNA 염기쌍의 효율을 표적 [11]위치로 수정하여 유전자 차별 발현을 달성할 수 있습니다.이론적으로 이 효율성을 조절하는 것은 주어진 유전자에 대한 대립유전자 계열을 만드는 데 사용될 수 있으며, 본질적으로 하이포모프와 하이퍼모프의 집합을 만드는 데 사용될 수 있습니다.이 강력한 수집품들은 어떤 유전자 조사에도 사용될 수 있습니다.하이포머형의 경우, 이는 유전자 녹아웃의 이진성 및 녹다운의 예측 불가능성과 대조적으로 유전자 기능의 점진적 감소를 허용합니다.하이퍼모프의 경우, 이는 가변 강도를 가진 프로모터 하에서 관심 유전자를 복제하는 기존의 방법과 대조적입니다.

유전체 위치 영상학

형광 단백질을 dCas9에 융합하는 것은 살아있는 인간 [18]세포의 게놈 위치의 영상화를 가능하게 합니다.FIX(Situ Hybridization)의 형광과 비교하여, 이 방법은 염색체 위치의 동적 추적을 독특하게 허용합니다.이것은 HeLa 세포를 포함한 실험실 세포주에서 염색질 구조와 핵 조직 역학을 연구하는 데 사용되었습니다.

줄기세포

CRISPRa에 의한 야마나카 인자의 활성화는 iPS [19][20]기술에 대한 대안적인 방법을 제공하는 인간 및 마우스 세포에서 만능성을 유도하기 위해 사용되었습니다.또한, 대규모 활성화 스크린은 유도 다능성을 촉진하는 단백질을 식별하거나 반대로 특정 세포 [21]계통으로의 분화를 촉진하는 데 사용될 수 있습니다.

유전자 선별 검사

단일 sgRNA로 dCas9-SunTag를 사용하여 유전자 발현을 과잉 조절할 수 있는 능력은 또한 Purb-seq와 같은 대규모 유전자 화면을 열어 유전자 발현의 증가 또는 감소로 인한 표현형을 밝혀낼 수 있으며,[22] 이는 암에서 유전자 조절의 효과를 이해하는 데 특히 중요할 것입니다.또한, CRISPRi 시스템은 박테리아 접합과 같은 수평 유전자 전달 메커니즘을 통해 전달 가능한 것으로 나타났으며, 수용체 세포에서 리포터 유전자의 특이적 억제가 입증되었습니다.크리스퍼i는 유전자 검사와 잠재적인 박테리아 개체수 [23]조절을 위한 도구의 역할을 할 수 있습니다.

장점과 한계

이점

  1. CRISPRi는 99.9%[11] 억제까지 관심있는 목표 유전자를 잠재울 수 있습니다.억제 강도는 가이드 RNA와 표적 간의 상보성의 양을 변경함으로써 조정될 수도 있습니다.유도성 프로모터와 달리 CRISPRi에 의한 부분 억제는 표적의 [15]표현에 전사 잡음을 추가하지 않습니다.억제 수준은 DNA 염기서열로 암호화되기 때문에,[24] 다양한 발현 수준은 경쟁에서 성장하고 염기서열 분석에 의해 확인될 수 있습니다.
  2. CRISPRi는 sgRNA-DNA의 Watson-Crick 염기쌍과 NGG PAM 모티프를 기반으로 하기 때문에 게놈 내에서 대상이 될 수 있는 부위의 선택이 간단하고 유연합니다.신중하게 정의된 프로토콜이 [11]개발되었습니다.
  3. 다중 sgRNA는 여러 개의 다른 유전자를 동시에 제어하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 동일한 유전자 타겟을 조절하는 효율성을 향상시키기 위해 사용될 수 개의 sgRNA는 여러 개의 다른 유전자를 동시에 제어하는 데 사용될 수 있습니다.다수의 sgRNA를 동시에 표현하는 일반적인 전략은 다수의 프로모터 또는 프로세싱 요소를 가진 단일 구성체에서 sgRNA를 배열하는 것입니다.예를 들어, ELSA(Extra-Long sgRNA Array)는 비반복적인 부분을 사용하여 유전자 합성 제공자로부터 12-sgRNA 어레이를 직접 합성할 수 있고, 상동 재조합이 일어나지 않고 대장균 게놈에 직접 통합될 수 있으며, 동시에 많은 유전자를 목표로 하여 복잡한 표현형을 [25]달성할 수 있습니다.
  4. 두 시스템은 상호 보완적일 수 있지만, CRISPRi는 RNAi에 비해 장점을 제공합니다.CRISPRi는 외생성 시스템으로서 마이크로RNA 발현이나 기능과 같은 내생성 기계와 경쟁하지 않습니다.또한, CRISPRi는 DNA 수준에서 작용하기 때문에 비코딩 RNA, 마이크로RNA, 안티센스 전사체, 핵-국소화 RNA, 중합효소 III 전사체 등의 전사체를 표적으로 할 수 있습니다.마지막으로, CRISPRi는 훨씬 더 큰 타겟팅 가능한 시퀀스 공간을 보유하고 있습니다. 프로모터와 이론적으로 인트론도 [16]타겟팅될 수 있습니다.
  5. 대장균에서 유전자 녹다운 균주의 구축은 매우 빠르며 한 단계 올리고 [6]재조합만 필요합니다.

한계

  1. 원형 공간 인접 모티프(PAM) 시퀀스의 요구 사항은 잠재적인 대상 시퀀스의 수를 제한합니다.Cas9와 그 호몰로그는 서로 다른 PAM 서열을 사용할 수 있으므로 이론적으로 잠재적인 표적 [11]서열의 수를 확장하는 데 사용될 수 있습니다.
  2. 표적 위치에 대한 서열 특이성은 14nt 길이(sgRNA 12nt 및 PAM 2nt)에 불과하며, 이는 인간 [11]게놈에서 약 11번 재발할 수 있습니다.압축은 전사 시작 부위로부터 대상 부위의 거리와 역 상관 관계가 있습니다.유전체 전반의 계산 예측 또는 더 긴 PAM을 가진 Cas9 상동체의 선택은 비특이적인 타겟팅을 줄일 수 있습니다.
  3. 내인성 염색질 상태 및 변형은 dCas9-sgRNA [11]복합체의 서열 특이적 결합을 방지할 수 있습니다.포유류 세포의 전사 억제 수준은 유전자마다 다릅니다.결합 및 조절 효율과 관련하여 국소 DNA 순응 및 염색질의 역할을 이해하기 위해서는 많은 연구가 필요합니다.
  4. CRISPRi는 표적 유전자에 근접한 유전자에 영향을 줄 수 있습니다.이것은 다른 유전자와 중첩되거나(감각 또는 안티센스 중첩) 양방향 [26]프로모터에 의해 구동되는 유전자를 표적으로 할 때 특히 중요합니다.
  5. 서열 특이적 독성은 진핵생물에서 보고되었으며, PAM-근위 영역의 일부 서열은 큰 적합성 [27]부담을 야기합니다."나쁜 씨앗 효과"라고 불리는 이 현상은 아직 설명할 수 없지만 dCas9의 [28]발현 수준을 최적화함으로써 감소될 수 있습니다.

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