웨스턴 블롯 정규화

Western blot normalization

Western block data의 정상화는 다양한 실험 치료 하에서 블락이나 젤의 차선이나 조직이나 발달 단계에 걸쳐 특정 단백질의 상대적 풍부함을 비교하기 위해 수행되는 분석 단계다.[1][2]정규화의 전반적인 목표는 일관성 없는 샘플 준비, 젤 레인에 걸친 불균일한 샘플 하중, 또는 Western Block 데이터에서 얻을 수 있는 결론을 손상시킬 수 있는 불균일한 단백질 전달과 같은 실험 오류의 변화로 인한 영향을 최소화하는 것이다.[1]현재 Western Blot 데이터를 정규화하는 방법에는 (i) 하우스키핑 단백질 정규화와 (ii) 총 단백질 정규화 두 가지가 있다.[1][2][3][4]null

절차

정상화는 젤이나 블러팅 막에서 직접 발생한다.먼저 스테인드젤이나 블럭이 이미징되고 각 차선마다 목표 단백질을 중심으로 직사각형이 그려지며 직사각형 내부의 신호 강도를 측정한다.[1]그런 다음 동일한 젤 또는 블럭에서 검출된 부하 내부 제어의 신호 강도에 대해 얻은 신호 강도를 정규화할 수 있다.[1]단백질 얼룩을 사용할 때, 막은 얼룩의 종류에 따라 면역검출 전이나 후에 선택된 얼룩과 함께 배양될 수 있다.[5]null

하우스키핑 단백질 제어

β-Actin, GAPDH, HPRT1, RPLP1을 포함한 하우스키핑 유전자와 단백질은 실험에 걸쳐 동일한 수준에서 구성적으로 표현되는 것으로 생각되기 때문에 종종 서부 블롯의 내부 대조군으로 사용된다.[1][2][6][7]그러나 최근의 연구는 하우스키핑 단백질(HKP)의 발현이 다른 세포 유형과 생물학적 조건에 따라 변할 수 있다는 것을 보여주었다.[1][8][9][10]따라서 과학 출판사와 자금 조달 기관은 이제 결과의 재현성과 정확성을 보장하기 위해 각 실험에 대해 표준화 통제를 이전에 검증할 것을 요구한다.[8][9][10]null

형광항체

서양의 블롯에서 단백질을 영상화하기 위해 형광 항체를 사용할 때, 정상화는 사용자가 정량화의 상한과 하한을 정의하고 각 항원에 대한 신호 강도와 샘플 질량 사이의 선형 관계를 특징지을 요구한다.[1]대상 단백질과 정규화 제어 모두 동적 검출 범위 내에서 형광 투과할 필요가 있다.[1]많은 HKP들은 높은 수준으로 표현되며, 고도로 표현된 표적 단백질과 함께 사용하기 위해 선호된다.[1]낮은 발현 단백질은 같은 얼룩에서 발견하기 어렵다.[1]null

형광 항체는 상업적으로 이용할 수 있으며, 결과의 일관성을 보장하기 위해 완전 특성화된 항체가 권장된다.[11][12][13]null

형광 검출이 활용되지 않을 때는 부하조절 단백질과 관심 단백질이 분자량에서 현저히 달라야 하므로 정확한 분석을 위해 젤 전기영양증에 의해 적절히 분리된다.[1]null

멤브레인 스트리핑

같은 얼룩에 여러 단백질 표적을 검출할 때는 새로운 검출 항체 세트를 이용해 막의 벗겨내고 재프로핑이 필요하다.[6]비효율적인 박리는 대상 단백질로부터 약한 신호를 초래할 수 있다.[6]항원 상실을 방지하기 위해 막당 3개의 박토 인큐베이팅만 권장한다.[6]고농축 단백질의 신호를 완전히 제거하기 어려울 수 있으므로 저농축 단백질을 먼저 검출하는 것이 좋다.[6]null

외부 스파이크인 컨트롤

HKP 수치는 조직 간에 일관성이 없을 수 있기 때문에, 과학자들은 항체의 선형 범위 내에서 알려진 농도의 순수하고 외생적인 단백질을 스파이크하여 관심 단백질을 조절할 수 있다.[8][9][10]HKP에 비해 스파이크인 제어에 보다 다양한 단백질이 이용 가능하다.[14]null

총단백질정상화

총단백질정상화(TPN)에서는 대상단백질의 풍부함이 각 차선의 총단백질량으로 정상화된다.[3][4]TPN은 단일 부하 제어에 의존하지 않기 때문에 HKP 탐지를 위한 제어장치의 검증과 블롯의 박리/재프로그래밍이 필요하지 않다.[6][15]이를 통해 정밀도(차선당 총 단백질의 0.1µg까지 감소), 비용 효율성 및 데이터 신뢰성을 향상시킬 수 있다.[16]null

형광 얼룩과 얼룩이 없는 젤은 젤/블롯의 단백질을 시각화하기 위한 특별한 장비가 필요하다.[5]얼룩은 얼룩을 고르게 덮지 못할 수 있으며, 얼룩의 가장자리로 중앙보다 더 많은 얼룩이 모일 수 있다.영상의 균일하지 않으면 정규화가 부정확할 수 있다.[1]null

항균성 전 얼룩

폰소S, 쿠오매시 같은 음이온성 염료와 시프로 루비, 딥 퍼플 같은 형광 염료는 하류 면역 검출에 영향을 주지 않기 때문에 항체가 추가되기 전에 사용된다.[17][18][19][20]null

폰소S는 음전하 가역성 염료로 단백질을 적분홍색으로 얼룩지게 하고 물에 씻으면 쉽게 제거된다.[21][22]Ponceau S stating의 강도는 시간이 지남에 따라 빠르게 감소하므로 문서화는 신속하게 수행되어야 한다.[5]시간 의존도가 높고 신호 대 잡음 비율이 낮아 재현성이 떨어지는 폰소 S의 선형 범위는 최대 140µg으로 보고된다.[21][22]null

시프로 루비와 같은 형광 염료는 선형 범위가 넓고 음이온 염료보다 민감하다.[22]그것들은 표준 UV나 청색 광선 투과기 또는 레이저 스캔으로 시각화할 수 있는 영구적인 광자극 얼룩이다.[1][22]그런 다음, 막은 충전 커플링 장치 카메라를 사용하여 필름 또는 디지털로 문서화할 수 있다.[23]Sypro Ruby Block Staining은 시간이 많이 걸리고 차선당 50μg 이상의 단백질을 포화시키는 경향이 있다.[22]null

항정신병 후 얼룩

아미도 블랙은 흔히 사용되는 항정신병 후 음이온 얼룩으로 폰소 S보다 민감하다.[24]이 얼룩은 면역억제 후에 바른다.[24]null

무색소 기술

얼룩 없는 기술은 이미징을 위해 골내 화학물질을 사용한다.[22][25][26]이 화학반응은 단백질 전달이나 다운스트림 항체 결합에는 영향을 미치지 않는다.[27]또한, 그것은 얼룩/대상 단계를 포함하지 않으며, 밴드들의 강도는 시간이 지남에 따라 일정하게 유지된다.[28]null

얼룩 없는 기술은 트립토판 잔류물을 함유하지 않은 단백질을 검출할 수 없다.탐지가 가능하려면 최소 두 개의 트립토판이 필요하다.[5]무색점 정규화를 위한 선형 범위는 18-웰의 경우 차선당 최대 80µg, 12-웰 기준 중간 크기 겔의 경우 차선당 최대 100µg이다.이 범위는 정량적 웨스턴 블럭의 전형적인 단백질 부하와 호환되며 광범위한 단백질 부하 범위에서 부하 제어 계산을 가능하게 한다.[29][4]보다 효율적인 얼룩 없는 방법 또한 최근에 사용 가능하게 되었다.[30][31]높은 단백질 부하를 사용할 때, 무색소 기술은 얼룩보다 더 큰 성공을 보여주었다.[29]null

참조

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