형광-평생 영상 현미경

형광-평생 영상 현미경 또는 FLIM은 표본에서 플루오포어의 광자 방출의 기하급수적인 붕괴율의 차이를 바탕으로 한 영상 기법이다.콘포칼로컬 현미경, 투포톤 흥분현미경, 멀티호톤 단층촬영 등에서 영상 기법으로 활용할 수 있다.

그 강도가 아닌 플루오르포어의 형광 수명(FLT)을 사용하여 FLIM에서 이미지를 생성한다.형광 수명은 형광원의 국소 미세 환경에 따라 달라지기 때문에 광원의 밝기 변화, 배경 광도 또는 제한된 광 블리딩으로 형광 강도에서 잘못된 측정을 방지할 수 있다.이 기법은 또한 두꺼운 샘플 층에서 광자가 산란하는 효과를 최소화할 수 있는 장점이 있다.미세 환경에 의존하여 평생 측정은 pH,^[1] 점성^[2], 화학종 농도의 지표로 사용되어 왔다.^[3][4]

형광 수명

광자에 의해 흥분되는 불소포는 여러 가지 다른 (방사성 및/또는 비방사성) 붕괴 경로를 통해 붕괴율에 근거한 일정한 확률로 지면 상태로 떨어진다.형광을 관찰하기 위해서, 이러한 경로들 중 하나는 광자의 자발적인 방출에 의한 것이어야 한다.앙상블 설명에서 방출되는 형광은 시간에 따라 부패한다.

$[\displaystyle I(t)=]I_{0}e^{-t/\tau }}}$

어디에

${\displaystyle \frac{1}{}}$ ${\displaystyle \frac{\tau }{}}$= ${\displaystyle \sum {}_{}}$ ${\displaystyle i_{}}$ ${\$

In the above, ${\displaystyle t}$ is time, ${\displaystyle \tau }$ is the fluorescence lifetime, ${\displaystyle I_{0}}$ is the initial fluorescence at ${\displaystyle t=0}$, and ${\displaystyle k_{i}}$ are the rates for each decay pathway, at least one of which must be the fluorescence decayrate ${\displaystyle k_{}}$ ${\$ 더 중요한 것은 수명 $\tau {\displaystyle }$ ${\displaystyle \tau}$이(가) 초기 강도와 방출된 빛과 무관하다는 점이다$$.이는 화학적 감지에서 비강도에 기반한 측정을 하는 데 활용될 수 있다.^[5]

측정

형광-수명 영상촬영은$flu{\displaystyle }$ {\$displaystyle \tau$ $\}$에 의해 결정된 각 픽셀의 강도로 영상을 산출하여 형광 붕괴율이 다른 물질 간의 대비를 볼 수 있으며(정확히 동일한 파장에서 형광 투시되는 경우에도) 다른 부패 경로의 변화를 보여주는 영상도 제작한다.s(예: FET 영상).

펄스 조명

형광 수명은 펄스 소스를 사용하여 시간 영역에서 결정할 수 있다.불소포자 집단이 울트라소트 또는 빛의 델타 펄스에 의해 흥분할 때, 시간적으로 분해된 형광은 위에서 설명한 바와 같이 기하급수적으로 붕괴될 것이다.그러나 흥분 펄스나 검출 반응이 넓을 경우 측정된 형광(d)(t)이 순수하게 지수적이지는 않을 것이다.계측응답함수 IRF(t)는 붕괴함수 F(t)와 합치되거나 혼합된다.

${\d}(t)={IRF}(t)\회수 {F}(t)}$

소스, 검출기 및 전자장치의 계측 응답은 일반적으로 산란된 흥분등에서 측정할 수 있다.분모가 0에 가까울 때 주파수 영역의 구분이 높은 소음을 발생시키는 경향이 있기 때문에 붕괴 기능(및 해당 수명)을 회복하는 것은 추가적인 난제를 야기한다.

TCSPC

시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC)는 선원의 강도 및 단일 광자 펄스 진폭의 변동을 보상하기 때문에 일반적으로 사용된다.상용 TCSPC 장비를 사용하면 형광 붕괴 곡선을 시간 분해능이 405 fs까지 감소하여 기록할 수 있다.^{[citation needed][6]} 기록된 형광 붕괴 히스토그램은 적합도 결정 시 고려되는 포아송 통계량을 준수한다.구체적으로는 TCSPC는 개별 광자가 흥분 레이저 펄스와 관련하여 고속 단일 광자 검출기(일반적으로 광전자 증배관(PMT) 또는 단일 광자 눈사태 광다이오드(SPAD)에 의해 검출되는 시간을 기록한다.이 기록은 여러 레이저 펄스에 대해 반복되며, 충분히 기록된 이벤트 후에, 이 기록된 모든 시점의 이벤트 수에 대한 히스토그램을 작성할 수 있다.이 히스토그램은 관심의 지수적인 수명 붕괴 함수를 포함하는 지수 함수에 적합할 수 있으며, 따라서 수명 매개변수를 추출할 수 있다.16^[7]~64개의 원소를 가진 다채널 PMT 시스템을 상업적으로 이용할 수 있는 반면, 최근에 입증된 CMOS 싱글 포토톤 눈사태 다이오드(SPAD)-TCSPC FLIM 시스템은 훨씬 더 많은 수의 검출 채널과 추가적인 저비용 옵션을 제공할 수 있다.^[8]

탕구법

맥박 흥분은 여전히 이 방법에서 사용된다.펄스가 샘플에 도달하기 전에 일부 빛이 이분 거울에 반사되고 CCD 검출기 앞에 위치한 게이트 광학증강기(GOI)를 제어하는 지연 발생기를 작동시키는 광다이오드에 의해 검출된다.GOI는 지연 후 열려 있는 시간의 일부분 동안만 탐지를 허용한다.따라서 조절 가능한 지연 발생기를 사용하면 표본의 형광 붕괴 시간 범위를 포괄하는 여러 지연 시간 후에 형광 방출을 수집할 수 있다.^[9][10]최근 몇 년간 통합 강화형 CCD 카메라가 시장에 출시되었다.이 카메라는 이미지 강화기, CCD 센서, 통합 지연 발생기로 구성되어 있다.최대 200ps의 최단 게이트 시간과 10ps의 지연 단계를 가진 ICCD 카메라는 나노초 미만의 해상도 FLIM을 허용한다.이 기술은 내시경과 결합하여 뇌종양의 수술 진단에 사용된다.^[11]

위상 변조

형광 수명은 위상 변조 방법에 의해 주파수 영역에서 결정될 수 있다.이 방법은 LED, 다이오드 레이저 또는 연속파 소스 등 고주파(최대 500MHz)에서 펄스 또는 변조되는 광원을 전기광 변조기 또는 음향광 변조기와 결합한 광원을 사용한다.형광은 (a) 강등 및 (b) 위상 이동이다. 두 수량은 모두 불소의 특성 붕괴 시간과 관련이 있다.또한 흥분 및 형광 사인파에 대한 y 성분도 변조되며, 이러한 y 성분들의 변조 비율에서 수명을 결정할 수 있다.따라서, 수명에 대한 2개의 값은 위상 변조 방법으로 결정할 수 있다.수명은 이러한 실험 매개변수의 적합 절차를 통해 결정된다.PMT 기반 또는 카메라 기반 주파수 영역 FLIM의 장점은 평생 이미지 획득이 빨라 라이브 셀 연구 등 용도에 적합하다는 점이다.^[12]

분석

이 글은 검증을 위해 인용구가 추가로 필요하다. 신뢰할 수 있는 출처에 인용문을 추가하여 이 기사를 개선할 수 있도록 도와주십시오. 공급되지 않은 재료는 도전하여 제거할 수 있다. 출처 찾기: "Fluorscence-Lifetime Imaging 현미경" – 뉴스 · 신문 · 책 · 학자 · JSTOR (2014년 5월) (이 템플릿 메시지를 제거하는 방법과 시기 학습)

분석 알고리즘의 목표는 측정된 붕괴로부터 순수 붕괴 곡선을 추출하고 수명을 추정하는 것이다.후자는 일반적으로 단일 또는 다중 지수 함수를 적합시켜 이루어진다.이 문제를 해결하기 위한 다양한 방법이 개발되었다.가장 널리 사용되는 기법은 잔차의 가중 합계 최소화에 기초한 최소 제곱 반복 재결합이다.이 기법에서 이론적 지수 붕괴 곡선은 별도로 측정되는 계측기 응답 함수와 교란되며, 최소값이 발견될 때까지 다른 입력에 대한 잔차를 반복 계산하여 최적의 적합성을 찾는다.$time{\displaystyle }$ bin i의 형광 신호$$ d (${\displaystyle t{}_{}}$ ${\displaystyle {}_{}}$) ${\displaystyle$ d$({t}_{i}}}})$ 집합에 대해 다음 값을 최소화하여 수명 추정을 수행한다.

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \i}{{i}{{d}_{i}}}}}-{d}_{{{d}_{{i}}}}}({t}_{{t}}}}}}},a,\tau )\ri}^{2}}:}$

파장에 의존하는 계측기 응답 기능을 포함한 실험적인 어려움 외에도 반복적 탈콘볼루션 문제의 수학적 처리가 직선적이지 않고 느린 과정으로 FLIM 초기에는 픽셀별 분석이 불가능하게 만들었다.비적합한 방법은 평생 추정에 대한 매우 빠른 해결책을 제공하기 때문에 매력적이다.이 범주의 중요하고 직접적인 기술 중 하나는 신속한 수명 결정(RLD) 방법이다.RLD는 붕괴 곡선을 동일한 폭 Δ ${\displaystyle \delta }$의 두 부분으로 나누어 수명 및 진폭을 직접 계산한다.분석은 붕괴 곡선을 동일한 시간 간격 $\Delta {\displaystyle }$ ${\displaystyle \delta }$ $t$:

${\displaystyle {\display}{{{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{{{{{}}I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits_{i=K/2}^{K}{{{{{D}}}}}}I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

i-th 채널에 기록된 신호는 i-th 채널, k는 채널 수입니다.수명은 다음을 사용하여 추정할 수 있다.

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}/{D}_{1}})}$

다중 지수 분석의 경우 이 방정식은 평균 수명을 제공한다.이 방법은 2-exponential decay를 분석하기 위해 확장될 수 있다.이 방법의 주요 단점 중 하나는 계측기 응답 효과를 고려할 수 없다는 것이며, 이러한 이유로 측정된 붕괴 곡선의 초기 부분은 분석에서 무시해야 한다는 것이다.이는 신호의 일부가 폐기되고 짧은 수명을 추정하는 정확도가 떨어진다는 것을 의미한다.

콘볼루션 정리의 흥미로운 특징 중 하나는 콘볼루션의 적분은 그 적분을 구성하는 요소들의 산물이라는 것이다.이 특성을 이용하여 측정된 곡선으로부터 순수한 붕괴 곡선을 복구하는 변환된 공간에서 작동하는 몇 가지 기술이 있다.라플레이스와 푸리에 변환은 라그에르 가우스 팽창과 함께 변환된 공간에서의 수명을 추정하는 데 사용되었다.이러한 접근법은 디콘볼루션 기반 방법보다 빠르지만 잘림과 샘플링 문제로 어려움을 겪는다.게다가, 라구에르 가우스 확대와 같은 방법의 적용은 수학적으로 복잡하다.푸리에 방법에서 단일 지수 붕괴 곡선의 수명은 다음과 같다.

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega}}{\frac {{A}_{n}}}{{B}_{n}}}}}}}}}}}}}}}}}{\frac {1}:{n}}}}}}$

위치:

${\displaystyle {\display}{{{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega}^{2}}:{\\tau{2}},\omega={\frac {2\pi }{T}\end{matrix}}}}}}}}}}}}}$

그리고 n은 고조파 수이고 T는 검출의 총 시간 범위다.

적용들

FLIM은 주로 세포와 종양의 광센시제를 검출하는 방법으로 생물학에서 주로 사용되어 왔으며, Ratiomic 영상촬영이 어려운 경우 FET도 검출되었다.이 기술은 1980년대 후반과 1990년대 초반에 개발되었다(Gating method:Bugiel 외 1989년.König 1989,^[13] 위상 변조: Rakowicz al. 1992년)^[14][15] 1990년대 후반에 더 널리 적용되기 전.세포 배양에서는 EGF 수용체 신호^[16] 전달 및 인신매매 연구를 위해 사용되어 왔다.^[17]시간 영역 FLIM(tdFLIM)은 또한 핵 봉투에 있는 구별되는 균등 고분자에서 A와 B1의 두 유형의 핵 중간 필라멘트 단백질의 상호작용을 보여주기 위해 사용되었고, 이는 더 높은 순서의 구조에서 상호 작용한다.^[18]FLIM 영상촬영은 뇌 조직에 의한 빛 산란 문제가 있는 뉴런에서 특히 유용하다.^[19]뉴런에서는 펄스 조명을 이용한 FLIM 영상촬영을 통해 Ras,^[20] CaMKII, Rac, Ran^[21] 계열 단백질을 연구해 왔다.FLIM은 임상 멀티호튼 단층 촬영에 사용되어 피부 내 암세포는 물론 제약 및 화장품 화합물까지 검출하고 있다.

보다 최근에는 FLIM이 식물 세포의^[22] 플라보올을 검출하는 데도 사용되었다.

NAD(P)H 및 FAD^[23] 형광 코엔자임

포유류 신진대사의 변화를 나타내는 지표로서 코엔자임에서 나오는 자동불색증을 검출하기 위해 멀티포톤 FLIM이 점점 더 많이 사용되고 있다.^[24]

FRET 영상화

플루오르포어의 형광 수명은 복사(즉, 형광)와 비방사성(즉, quenching, FAT) 공정 모두에 의존하므로, 기증자 분자에서 수용자 분자로의 에너지 전달은 기증자의 수명을 감소시킬 것이다.따라서 FLIM을 사용한 FET 측정은 불소포기의 상태/환경을 구별할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.^[25]강도 기반 FET 측정과 달리 FLIM 기반 FET 측정은 불소포체 농도에 무감각하므로 표본 전체의 농도 및 방출 강도 변화에 의해 유입된 아티팩트를 걸러낼 수 있다.

참고 항목

• 형광 수명과 스펙트럼 이미징에 대한 페이저 접근법

참조

외부 링크

• 형광 흥분 상태 수명 영상
• ImageJ: http://spechron.com의 수명 및 스펙트럼 분석 도구
• 형광 투시 수명 영상 현미경
• TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)의 원리