세포분열

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세포 분열은 세포 내부에서 생물학적 분자를 배출하는 방법이나 과정이다.null

방법들

복제와 배양 방법을 사용하여 생물학적으로 흥미로운 분자를 생산하면 관련 분자의 연구와 제조가 가능하다.배설된 분자를 제외하고 관심 분자를 생성하는 세포는 반드시 교란되어야 한다.이 페이지는 다양한 방법을 논하고 있다.또 다른 교란 방법은 셀 언루프팅이라고 불린다.null

비드법

세포 교란을 위한 일반적인 실험실 규모의 기계적 방법은 유리, 세라믹 또는 강철 비드 직경 0.1 ~ 2 mm를 수성 매체에 매달린 샘플과 혼합하여 사용한다.1970년대 후반 팀 홉킨스에 의해 처음 개발된 이 샘플과 구슬 혼합물은 저어지거나 흔들림으로써 고도의 동요를 받는다.구슬이 세포 샘플과 충돌하여 세포 간 구성품을 방출하기 위해 세포가 갈라진다.다른 방법들과 달리 기계전단은 균질화 시 중간 정도여서 막이나 세포하 준비력이 우수하다.종종 "비드비팅"이라고 불리는 이 방법은 포자에서부터 동물과 식물 조직에 이르는 모든 종류의 세포 물질에 잘 효과가 있다.가장 널리 사용되는 효모 용해법으로 50%(최대 95%)가 훨씬 넘는 파손을 발생시킬 수 있다.^[1]매우 작은 샘플 크기를 교란할 수 있고, 교차 오염 우려 없이 한 번에 많은 샘플을 처리할 수 있으며, 그 과정에서 잠재적으로 유해한 에어로졸을 방출하지 않는다는 장점이 있다.null

이 방법의 가장 간단한 예에서, 동일한 부피의 구슬이 시험관의 세포나 조직 서스펜션에 추가되고 샘플은 공통 실험실 소용돌이 혼합기에서 힘차게 혼합된다.특수 흔들림 기계에 비해 처리 시간이 3~10배 이상 걸리는 등 속도가 느리지만, 쉽게 흐트러지는 세포에 효과가 좋고 저렴하다.null

성공적인 비드비팅은 진동기의 설계 특징(분당 흔들림 진동, 흔들림 투척 또는 거리, 흔들림 방향 및 바이알 방향)뿐만 아니라 vi의 정확한 비드 크기(0.1~6mm 직경), 비드 조성(유리, 세라믹, 강철) 및 비드 하중 선택에 달려 있다.al.

대부분의 실험실에서 비드베팅은 1개에서 24개의 밀봉된 플라스틱 바이알 또는 원심분리 튜브의 배치 크기로 이루어진다.샘플과 작은 구슬은 고출력 전기 모터에 의해 구동되는 특수 설계된 왕복 셰이커에서 분당 약 2000회의 진동으로 동요한다.1-3분 흔들리면 세포분열이 완료된다.SoniBeast라고 불리는 비드비터 변동을 통해 훨씬 더 빠른 세포 분열 속도가 달성된다.기존 기계와 달리 20,000 oscl/min에서 소용돌이 동작을 이용해 구슬을 자극한다.딥웰 마이크로티터 플레이트를 고정하는 더 큰 비드비터 기계도 복수의 바이알이나 마이크로 플레이트에 구슬을 신속하게 적재하도록 설계된 비드 디스펜서가 그러하듯이 공정 시간을 단축한다.^[2][3]사전 탑재된 바이알과 마이크로플레이트도 이용할 수 있다.null

모든 고에너지 비드비팅 기계는 샘플을 10도/분 정도 데운다.균질화 과정에서 구슬의 마찰 충돌 때문이다.비드베팅 중 또는 후 샘플 냉각은 효소와 같은 열에 민감한 단백질의 손상을 방지하기 위해 필요할 수 있다.샘플 워밍업은 각 간격 사이에 얼음 위에서 냉각하면서 짧은 시간 간격 동안 비드베이트를 하거나, 미리 냉각된 알루미늄 바이알 홀더에서 바이알을 처리하거나, 비드베이트 중에 기체 냉각수를 기계로 순환시켜 제어할 수 있다.null

더 큰 샘플 용적에 적합한 다른 비드비터 구성은 15, 50 또는 200ml 챔버 내에서 회전하는 플루오르탄 로터를 사용하여 비드를 활성화한다.이 구성에서 챔버는 정적 냉각 재킷으로 둘러싸일 수 있다.이와 동일한 로터/챔버 구성을 사용하여 대형 상업용 기계는 수 리터의 셀 서스펜션을 처리할 수 있다.현재 이 기계들은 효모, 해조류, 박테리아와 같은 단세포 생물을 가공하는 것으로 제한되어 있다.null

극저온화

동물결합조직, 일부 종양생검체검사체, 정맥조직, 연골, 씨앗 등 단단한 세포외 기질을 가진 시료는 액체 질소 온도에서 충격 분쇄에 의해 미세한 분말로 줄어든다.극저온증이라고 알려진 이 기술은 물의 상당 부분을 포함하는 생물학적 샘플이 극도로 추운 온도에서 부서지기 쉽다는 사실에 근거한다.이 기술은 1975년 스머커와 피스터에 의해 처음 설명되었는데, 그는 이 기술을 극저온 작용이라고 언급하였다.저자들은 이 방법에 의해 세포가 효과적으로 파괴된다는 것을 증명했고, 위상과 전자 현미경으로 비행기가 세포벽과 세포막을 가로지르는 것을 확인했다.^[4]null

이 기법은 액체 질소 온도로 냉각된 모르타르와 페슬을 사용하여 수행할 수 있지만, 이 고전적인 기구를 사용하는 것은 고된 일이며 표본 손실이 종종 우려된다.일반적으로 티슈 펄버라이저로 알려진 특수 스테인리스강 펄버라이저도 이러한 목적으로 사용할 수 있다.수작업은 덜 필요하며, 좋은 샘플 회수를 제공하며 샘플 간 세척이 용이하다.이 기술의 장점은 작고 단단한 조직 샘플에서 단백질과 핵산의 생산량이 더 높다는 것이다. 특히 위에서 언급한 기계적 또는 화학적/솔루션 세포 파괴 방법의 예비 단계로 사용될 경우 더욱 그러하다.null

고압 셀 중단

1940년대 이후 고기압이 세포 분열의 한 방법으로 사용되어 왔는데, 가장 두드러진 것은 프랑스 압력 셀 프레스(French Pressure Cell Pressures) 또는 프랑스 프레스(French Pressures)이다.이 방법은 찰스 스테이시 프렌치(Charles Stacy French)가 개발한 것으로 고압력을 이용해 좁은 오리피스를 통해 세포를 강제로 통과시켜 압력 차이에 걸쳐 경험하는 전단력으로 인해 세포가 침윤하게 된다.^[5][6]프랑스 프레스사가 많은 미생물학 실험실에서 주요 품목이 된 반면, 그들의 생산은 대부분 중단되어 유사한 기술의 대체 적용이 부활하게 되었다.null

현대의 물리적 셀 교란기는 일반적으로 공압 또는 유압을 통해 작동한다.공압기계는 일반적으로 비용이 낮지만, 공기펌프의 스트로크 전체에 걸쳐 처리압력의 차이로 인해 성능을 신뢰할 수 없다.일반적으로 유압 기계는 피스톤 스트로크 내내 일정한 압력을 유지하는 능력 때문에 특히 효모나 그램 양성 박테리아와 같은 샘플을 분해하기 위해 더 열심히 가공할 때 우수한 라이싱 능력을 제공하는 것으로 간주된다.수압으로 운영되는 프렌치 프레스(French Press)는 가장 흔히 사용되는 세포 타입의 90%이상의 용해가 가능하기 때문에 용해 성능에서 금본위제로 받아들여지는 경우가 많고, 현대적인 기계는 용해 효율뿐만 아니라 안전성과 사용 편의성 측면에서도 비교되는 경우가 많다.일부 제조업체들은 또한 오리피스를 통해 샘플을 구동시키는 압력 외에 이들 기계 내의 특성을 변경함으로써 전통적인 디자인을 개선하려고 노력하고 있다.그러한 예로는 최근 셀 교란기가 전통적인 프랑스 언론의 성과와 일치할 뿐만 아니라 훨씬 낮은 전력으로 동일한 결과를 얻기 위해 노력하고 있다는 것을 보여준 콘스탄트 시스템즈가 있다.^[7]null

PCT(Pressure Cycling Technology)는 특허받은 기술 플랫폼으로, 주변과 초고층(최대 9만 psi) 사이에서 정수압의 교대 사이클을 이용해 생물 검체 내 분자의 작용을 안전하고 편리하며 재현적으로 제어할 수 있다(예: 인간으로부터 세포와 조직의 파열(합성)).동물, 식물, 미생물 공급원과 병원균의 불활성화PCT 강화 시스템(기기 및 소모품)은 생물학적 샘플 준비에 내재된 몇 가지 어려운 문제를 다룬다.PCT의 장점은 다음과 같다: (a) 더 많은 막단백질의 추출 및 회복, (b) 단백질 소화 강화, (c) 혼합 샘플 베이스에서의 차등 용해, (d) 병원체 비활성화, (e) DNA 검출 증가, (f) 정교한 샘플 준비 프로세스 제어.^[8]null

세포 분열에 사용되는 마이크로플루이저 방법은 입자 크기, 점성, 단백질 산출량, 효소 활성과 같은 라이스 세포 서스펜션의 물리화학 특성에 강한 영향을 미친다.최근 몇 년 동안 마이크로플루이드라이저 방식은 사용의 용이성과 많은 종류의 셀을 교란시키는 효율성으로 인해 셀 교란에서 인기를 얻었다.마이크로플루이저 기술은 아서 D라는 회사로부터 허가를 받았다.리틀(Little)은 1980년대에 처음 개발되어 활용되었으며, 처음에는 지질 생성의 도구로 시작되었다.그 이후로 그것은 세포 분열 나노 유화, 고체 입자 크기 감소와 같은 다른 애플리케이션에서 사용되었다.null

고정된 기하학적 구조를 가진 마이크로 채널과 강화기 펌프를 사용함으로써 셀을 파열시키는 높은 전단률이 생성된다.이 세포 투석 방법은 대장균 세포의 90%이상의 파괴를 산출할 수 있다.^[9]null

많은 단백질은 극도로 온도에 민감하며, 많은 경우 섭씨 4도의 온도에서 변성하기 시작할 수 있다.마이크로채널 내에서 온도는 섭씨 4도를 넘지만, 이 기계는 셀이 상승된 온도에 노출되는 시간이 극히 짧도록(지하시간 25ms-40ms) 빠르게 냉각되도록 설계되어 있다.이러한 효과적인 온도 조절 때문에 마이크로 유체이저는 단백질이 온도에 민감할 때 다른 기계적인 방법보다 더 높은 수준의 활성 단백질과 효소를 생산한다.^[10]null

세포 교란 시 점성 변화도 자주 관찰된다.셀 서스펜션 점도가 높을 경우 여과 및 정확한 피펫팅 등 다운스트림 처리가 어려울 수 있다.Microfluidizer로 관찰된 점도의 변화는 상대적으로 낮으며, 기계를 추가로 통과하면 감소한다.^[11]null

다른 기계파괴법과 달리 마이크로유이제는 효율적이면서도 부드럽게 세포막을 부수어 세포벽 파편(450nm)이 상대적으로 커 세포 내용물의 분리가 용이하다.이는 여과 시간을 단축하고 원심분리 시간을 개선할 수 있다.^[12]null

마이크로 유체이저 기술은 1밀리미터에서 수천 리터까지 확장된다.null

질소감압

질소 감압의 경우, 먼저 다량의 질소가 적절한 압력 용기 내의 고압에서 셀에 용해된다.그러다가 가스 압력이 갑자기 방출되면 각 세포의 막이 파열되어 세포의 내용물을 방출할 때까지 팽창하는 거품이 팽창하면서 질소가 용액에서 나온다.null

질소 감압은 초음파 및 기계적 균질화 방법보다 효소와 유기체를 더 보호하며, PTFE 및 유리 모르타르 및 페슬 균질화기에서 얻은 제어된 파괴 작용에 유리하게 비교된다.^[13]다른 파괴적 방법은 열을 발생시키는 마찰이나 기계적 피복 작용에 의존하지만, 질소 감압 절차는 샘플을 가열하는 대신 냉각시키는 부차적 팽창이 동반된다.null

셀 서스펜션과 균질산을 포화시키는 불활성 질소 가스의 담요는 셀 구성 요소의 산화 방지 기능을 제공한다.이 기법에는 이산화탄소, 아산화질소, 일산화탄소, 압축공기 등 다른 기체가 사용되었지만 질소는 반응성이 없고 정지 매질의 pH를 변경하지 않기 때문에 선호된다.또한 질소는 일반적으로 낮은 비용과 이 절차에 적합한 압력에서 이용할 수 있기 때문에 선호된다.null

일단 방출되면, 세포 이하의 물질은 샘플을 변성시키거나 원치 않는 손상을 일으킬 수 있는 지속적인 감소에 노출되지 않는다.효소 활성도와 붕괴율 사이의 최고점을 지켜볼 필요는 없다.질소 거품이 각 셀 내에서 발생하기 때문에 동일한 파괴력이 샘플 전체에 균일하게 작용하여 제품의 비정상적인 균일성을 보장한다.세포가 없는 균질체는 생산될 수 있다.null

이 기법은 세포와 조직을 균질화시키고, 온전한 오르간젤을 방출하며, 세포막을 준비하며, 실험용 생화물을 방출하고, 표본을 극도의 화학적 또는 물리적 스트레스에 노출시키지 않고 균일하고 반복 가능한 균질화합물을 생산하는 데 사용된다.null

이 방법은 특히 포유류와 다른 막에 묶인 세포를 치료하는 데 적합하다.^[14]또한 식물 세포 치료, 수정란에서 바이러스를 방출하고 연약한 박테리아를 치료하는데도 성공적으로 사용되었다.치료되지 않은 박테리아 세포에는 권장하지 않는다.세포벽이 단단한 효모, 곰팡이, 포자, 기타 물질은 이 방법에 잘 반응하지 않는다.null

참고 항목

• 초음파 균질화제
• 소닉
• 균질화(화학)
• 균질화제

참조