세포 배양에서 아미노산에 의한 안정적 동위원소 라벨링

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture
SILAC의 원리. 세포는 일반 아르기닌(Arg-0, Blue color)이 있는 가벼운 매개체 또는 헤비 아르기닌(Arg-6, red color)이 있는 매개체로 성장하여 차등 라벨을 붙인다. 아미노산을 단백질에 대사적으로 결합하면 해당 펩타이드의 대량 이동이 발생한다. 이 질량 이동은 표시된 질량 스펙트럼에 표시된 질량 분광계로 감지할 수 있다. 두 표본이 결합될 때 질량 스펙트럼의 피크 강도 비율은 상대 단백질 풍부도를 반영한다. 이 예제에서 라벨링된 단백질은 두 표본 모두에서 같은 풍부함을 가진다(비율 1).

안정적 동위원소 라벨링 세포배양(SILAC)은 질량 분광법에 근거한 기법으로, 비방사성 동위원소 라벨링(Non-Radioactive 동위원소 라벨링)을 사용하여 샘플 간의 단백질 풍부도 차이를 검출한다.[1][2][3][4] 그것은 정량적 프로테오믹스의 인기 있는 방법이다.

절차

세포의 두 집단은 세포 배양에서 배양된다. 세포군 중 하나는 정상 아미노산을 함유한 성장 매개체로 공급된다. 이와는 대조적으로, 두 번째 모집단은 안정적(비방사능적) 중동위원소로 라벨이 붙어 있는 아미노산을 함유한 성장 매체를 섭취한다. 예를 들어, 매체는 일반 탄소-12(12C) 대신에 6개의 탄소-13 원자(13C)로 표시된 아르기닌을 포함할 수 있다. 세포들이 이 매개체에서 자라고 있을 때, 그들은 무거운 아르기닌을 그들의 모든 단백질에 통합한다. 그 후, 단일 아르기닌을 함유한 모든 펩타이드들은 일반 펩타이드보다 6Da 더 무겁다. 또는 C 또는 N으로 균일한 라벨링을 사용할 수 있다. 질량 차이로 인해 질량 분광기에서 서로 다른 안정 이소토프 구성의 화학적으로 동일한 펩타이드 쌍이 구별될 수 있기 때문에 두 세포군에서 나온 단백질은 질량 분광기에 의해 결합되고 분석된다. 그러한 펩타이드 쌍에 대한 질량 스펙트럼의 피크 강도 비율은 두 단백질에 대한 풍부비를 반영한다.[5][3]

적용들

일반 탄소-12(12C)가 아닌 9개의 탄소-13 원자(13C)로 표시된 타이로신의 통합과 관련된 SILAC 접근방식은 신호 경로에서 타이로신 키나아제 기판을 연구하기 위해 이용되었다.[6] SILAC는 세포 신호, 인산화,[6][7] 단백질-단백질 상호작용, 유전자 발현 조절과 같은 후번역 변화를 연구하는 매우 강력한 방법으로 부상했다. 게다가 SILAC는 분비 단백질과 분비 경로에 대한 세계적 연구인 분비물학에서 중요한 방법이 되었다.[8] 배양 세포에 의해 분비되는 단백질과 혈청 오염물질을 구별하는 데 사용할 수 있다.[9] 다양한 애플리케이션을 위한 SILAC의 표준화된 프로토콜도 발표되었다.[10][11]

실락은 진핵 세포와 세포 배양에 주로 사용되어 왔으나, 최근에는 내성이 있는 박테리아와 항생제 내성의 다세포 바이오필름에 고용되어 내성과 민감한 서브플로를 구별하고 있다.[12]

펄스 SILAC

펄스 SILAC(pulsed silac, pSILAC)는 라벨링된 아미노산이 단기간 동안만 성장 매체에 첨가되는 SILAC 방식의 변형이다. 이를 통해 생농도보다는 디노보 단백질 생산의 차이를 모니터링할 수 있다.[13]

또한 내성과 민감성을 구별하기 위해 항생제에 대한 바이오필름 내성을 연구하기 위해 사용되었다.

뉴코드 SILAC

전통적으로 SILAC의 멀티플렉싱 수준은 이용 가능한 SILAC 동위원소의 수 때문에 제한적이었다. 최근 NeuCode(중성자 인코딩) SILAC라는 새로운 기술이 대사 라벨링(최대 4개)[14]으로 멀티플렉싱 수준을 높였다. NeuCode 아미노산 방법은 SILAC와 유사하지만 라벨링은 중아미노산만을 활용한다는 점에서 차이가 있다. 중아미노산만 사용하면 SILAC에 필요한 아미노산을 100% 통합할 필요가 없다. NeuCode 아미노산의 증가된 멀티플렉싱 능력은 안정적 동위원소 내 여분의 중성자로부터의 질량 결함을 사용함으로써 얻어진다. 그러나 이러한 작은 질량 차이는 고해상도 질량 분광기에서 해결할 필요가 있다.

참조

  1. ^ Oda Y, Huang K, Cross FR, Cowburn D, Chait BT (June 1999). "Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12): 6591–6. Bibcode:1999PNAS...96.6591O. doi:10.1073/pnas.96.12.6591. PMC 21959. PMID 10359756.
  2. ^ Jiang H, English AM (2002). "Quantitative analysis of the yeast proteome by incorporation of isotopically labeled leucine". J. Proteome Res. 1 (4): 345–50. doi:10.1021/pr025523f. PMID 12645890.
  3. ^ a b Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (May 2002). "Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics". Mol. Cell. Proteomics. 1 (5): 376–86. doi:10.1074/mcp.M200025-MCP200. PMID 12118079.
  4. ^ Zhu H, Pan S, Gu S, Bradbury EM, Chen X (2002). "Amino acid residue specific stable isotope labeling for quantitative proteomics". Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (22): 2115–23. Bibcode:2002RCMS...16.2115Z. doi:10.1002/rcm.831. PMID 12415544.
  5. ^ Schoeters, Floris; Van Dijck, Patrick (2019). "Protein-Protein Interactions in Candida albicans". Frontiers in Microbiology. 10: 1792. doi:10.3389/fmicb.2019.01792. ISSN 1664-302X. PMC 6693483. PMID 31440220.
  6. ^ a b Ibarrola N, Molina H, Iwahori A, Pandey A (April 2004). "A novel proteomic approach for specific identification of tyrosine kinase substrates using [13C]tyrosine". J. Biol. Chem. 279 (16): 15805–13. doi:10.1074/jbc.M311714200. PMID 14739304.
  7. ^ Ibarrola N, Kalume DE, Gronborg M, Iwahori A, Pandey A (November 2003). "A proteomic approach for quantitation of phosphorylation using stable isotope labeling in cell culture". Anal. Chem. 75 (22): 6043–9. doi:10.1021/ac034931f. PMID 14615979.
  8. ^ Hathout Y (April 2007). "Approaches to the study of the cell secretome". Expert Rev Proteomics. 4 (2): 239–48. doi:10.1586/14789450.4.2.239. PMID 17425459. S2CID 26169223.
  9. ^ Polacek, Martin; Bruun, Jack-Ansgar; Johansen, Oddmund; Martinez, Inigo (2010). "Differences in the secretome of cartilage explants and cultured chondrocytes unveiled by SILAC technology". Journal of Orthopaedic Research. 28 (8): 1040–9. doi:10.1002/jor.21067. PMID 20108312. S2CID 41057768.
  10. ^ Amanchy R, Kalume DE, Pandey A (January 2005). "Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) for studying dynamics of protein abundance and posttranslational modifications". Sci. STKE. 2005 (267): pl2. doi:10.1126/stke.2672005pl2. PMID 15657263. S2CID 12089034.
  11. ^ Harsha HC, Molina H, Pandey A (2008). "Quantitative proteomics using stable isotope labeling with amino acids in cell culture". Nat Protoc. 3 (3): 505–16. doi:10.1038/nprot.2008.2. PMID 18323819. S2CID 24190501.
  12. ^ a b Chua SL, Yam JK, Sze KS, Yang L (2016). "Selective labelling and eradication of antibiotic-tolerant bacterial populations in Pseudomonas aeruginosa biofilms". Nat Commun. 7: 10750. Bibcode:2016NatCo...710750C. doi:10.1038/ncomms10750. PMC 4762895. PMID 26892159.
  13. ^ Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M (January 2009). "Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC". Proteomics. 9 (1): 205–9. doi:10.1002/pmic.200800275. PMID 19053139. S2CID 23130202.
  14. ^ Merrill AE, Hebert AS, MacGilvray ME, Rose CM, Bailey DJ, Bradley JC, Wood WW, El Masri M, Westphall MS, Gasch AP, Coon JJ (September 2014). "NeuCode labels for relative protein quantification". Mol. Cell. Proteomics. 13 (9): 2503–12. doi:10.1074/mcp.M114.040287. PMC 4159665. PMID 24938287.

추가 읽기

외부 링크