라벨이 없는 정량화

Label-free quantification

라벨 없는 정량법은 두 개 이상의 생물 검체에서 단백질의 상대적 양을 결정하는 것을 목적으로 하는 질량 분광법이다. 다른 단백질 계량법과는 달리 라벨 없는 계량법에서는 화합물이 함유된 안정적 동위원소를 사용하여 단백질과 화학적으로 결합하여 라벨을 붙이지 않는다.[1][2]

실행

샘플 3개, LC-MS 파일 3개, 전구 이온/펩타이드 5개를 사용한 라벨 없는 정량 실험. 크로마토그래픽 피크의 정점에 있는 강도는 이 특별한 경우에 정량화를 위해 사용된다. 펩타이드들은 조각화 질량 스펙트럼을 통해 식별되며, 일부 전구 이온들은 정량화되지만 어떤 펩타이드 순서에 매핑되지는 않는다.

라벨이 없는 정량은 전구 신호 강도 또는 스펙트럼 계수에 기초할 수 있다. 첫 번째 방법은 새로운 세대의 비행 시간(ToF), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR) 또는 궤도랩 질량 분석기를 사용하여 얻은 것과 같은 고밀도 질량 스펙트럼에 적용할 때 유용하다. 고해상도 파워는 MS1 레벨에서 펩타이드 신호의 추출을 촉진하여 식별 프로세스에서 정량화를 분리한다. 대조적으로 스펙트럼 계수는 단순히 다른 생물 검체에서 주어진 펩타이드에 대해 식별된 스펙트럼의 수를 계산한 다음 정량화된 단백질의 모든 측정된 펩타이드에 대한 결과를 통합한다.

라벨 프리 어프로치의 연산 프레임워크에는 복수의 LC-MS 데이터에 걸쳐 해당 펩타이드의 검출, 해당 펩타이드의 매칭, 차별적 펩타이드의 선택이 포함된다.[3][4]

온전한 단백질 표현 분광법(IPEx)은 미국 식품의약품안전청(Food and Deduced Nutrum) 및 그 밖의 다른 곳에서 분석 화학 그룹이 개발 중인 질량 분광법에서 라벨이 없는 정량화 접근법이다. 온전한 단백질은 LCMS 기기로 분석되는데, 보통 종단 모드에서 4극 비행 시간을 분석하며, 완전한 단백질 프로파일은 데이터 감소 소프트웨어를 사용하여 결정되고 정량화된다. 초기 결과는 매우 고무적이다. 한 연구에서 포유류 검체로부터 복제된 치료법 두 그룹(치료 이력이 유사하지만 기술 복제가 아닌 다른 유기체)에 수십 개의 낮은 CV 단백질 바이오마커(biomarker)가 나타나 ICEx가 단백질 발현을 연구하기 위한 실행 가능한 기술임을 시사했다.[5]

펩타이드 검출

일반적으로 펩타이드 신호는 MS1 레벨에서 검출되며, 그 특징적인 동위원소 패턴을 통해 화학적 노이즈와 구별된다. 그런 다음 이러한 패턴을 보존 시간 차원에 걸쳐 추적하여 모노 이소토픽 펩타이드 질량의 크로마토그래픽 용출 프로파일을 재구성하는 데 사용한다. 그런 다음 펩타이드 신호의 총 이온 전류를 통합하여 원래의 펩타이드 농도의 정량적 측정으로 사용한다. 검출된 각 펩타이드에 대해 먼저 모든 동위원소 피크를 찾아 충전 상태가 할당된다.

라벨 없는 정량화는 전구 신호 강도에 기초할 수 있으며 격리 간섭으로 인한 문제를 가질 수 있다: 고투과 연구들에서 측정되고 있는 펩타이드 전구 이온의 정체는 m/z비 및 이전 펩타이드의 그것과 겹치는 시간 프레임에서 완전히 다른 펩타이드일 수 있다.. 스펙트럼 계수는 펩타이드의 식별으로 인해 문제가 발생하여 추가 MS/MS 스캔을 실행해야 하므로 시간이 걸리고 따라서 실험 분해능이 저하된다.

해당 펩타이드 매칭

미분 라벨 표시와 대조적으로 모든 생물학적 표본을 라벨이 없는 실험에서 별도로 측정해야 한다. 추출된 펩타이드 신호는 질량 대 충전 및 유지 시간 치수에 대한 좌표를 사용하여 소수 또는 복수 LC-MS 측정에서 매핑된다. 고밀도 정밀 계측기의 데이터는 이 프로세스를 크게 촉진하고 여러 런에 걸쳐 정확한 펩타이드 신호를 일치시킬 확률을 높인다.

분명히 생물 검체의 차등처리는 결과를 조정하는 데 사용할 수 있는 표준을 가질 필요가 있다. 다른 생물 검체에서 발현 수준의 변화가 예상되지 않는 펩타이드도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 그러나 모든 펩타이드들이 이온화 되는 것은 아니며 따라서 후보자들의 선택은 조사될 생물 검체의 단백질 함량만을 특징짓는 초기 연구 후에 이루어져야 한다.

차별 펩타이드 선택

마지막으로, LC-MS 측정 사이의 펩타이드 강도 값에서 체계적인 아르테팩트를 제거하기 위해 정교한 정규화 방법을 사용한다. 그런 다음 여러 표본군 중에서 정상화된 강도가 다른 펩타이드(예: p-값 < 0.05)를 선택하여 차별적 펩타이드(펩타이드)를 식별한다.

또한 LTQ OrbiTrap과 같은 최신 하이브리드 질량 분광기는 MS1 레벨에서 펩타이드의 고질량 정밀 측정과 병행하여 MS/MS 펩타이드 식별을 획득할 수 있는 가능성을 제공한다. 이로 인해 이 두 가지 정보 출처의 처리와 통합에 대한 계산적 난제가 대두되고, 새로운 유망한 계량화 전략의 개발로 이어졌다.

참조

  1. ^ Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B (October 2007). "Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4): 1017–31. doi:10.1007/s00216-007-1486-6. PMID 17668192.
  2. ^ Asara JM, Christofk HR, Freimark LM, Cantley LC (March 2008). "A label-free quantification method by MS/MS TIC compared to SILAC and spectral counting in a proteomics screen". Proteomics. 8 (5): 994–9. doi:10.1002/pmic.200700426. PMID 18324724.
  3. ^ Bridges SM, Magee GB, Wang N, Williams WP, Burgess SC, Nanduri B (2007). "ProtQuant: a tool for the label-free quantification of MudPIT proteomics data". BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7: S24. doi:10.1186/1471-2105-8-S7-S24. PMC 2099493. PMID 18047724.
  4. ^ Lukas N. Mueller; et al. (2008). "An Assessment of Software Solutions for the Analysis of Mass Spectrometry Based Quantitative Proteomics Data". Journal of Proteome Research. 7 (1): 51–61. CiteSeerX 10.1.1.336.4416. doi:10.1021/pr700758r. PMID 18173218.
  5. ^ 숄, PF, 혈청 바이오마커 개발을 위한 온전한 단백질 LC/MS 전략: 트리테르페노이드 CDDO-Im, Obstract, TOA 8시 35분. ASMS 콘퍼런스, 2007.