정량적 프로테오믹스

Quantitative proteomics
양적 질량 분석.

정량적 프로테오믹스는 표본 내 단백질 양을 결정하기 위한 분석 화학 기법이다.[1][2][3] 단백질 식별 방법은 일반적(즉, 질적) 단백질학에서 사용되는 방법과 동일하지만, 추가적인 차원으로서 정량화를 포함한다. 특정 샘플에서 식별된 단백질 목록을 단순히 제공하는 것이 아니라, 정량적 프로테오믹스는 두 생물학적 샘플 사이의 생리학적 차이에 대한 정보를 산출한다. 예를 들어, 이 접근방식은 건강하거나 병든 환자의 샘플을 비교하는 데 사용될 수 있다. 정량적 프로테오믹스는 주로 2차원 겔 전기영동(2-DE)이나 질량분석(MS)에 의해 수행되지만, 최근 개발된 정량적 도트 블록(QDB) 분석 방법은 샘플 내 개별 단백질의 절대량과 상대적 양을 모두 높은 처리량 형식으로 측정할 수 있어 새로운 방향을 열 수 있다. 단백질의 연구 다운스트림 단백질 식별을 위해 MS가 필요한 2-DE와는 대조적으로 MS 기술은 변화를 식별하고 정량화할 수 있다.

분광측정법을 이용한 정량화

표본 내 특정 단백질의 농도는 분광학적 절차를 사용하여 결정할 수 있다.[4] 단백질의 농도는 분광체계의 280nm에서 OD를 측정하여 결정할 수 있으며, 이는 트립토판, 티로신, 페닐알라닌의 유무를 정량화하는 데 표준 곡선 분석과 함께 사용할 수 있다.[5] 그러나 단백질의 구성이 크게 달라질 수 있고 이 방법은 앞서 언급한 아미노산을 함유하지 않은 단백질을 정량화할 수 없기 때문에 이 방법이 가장 정확하지는 않다. 핵산 오염 가능성 때문에 이 방법도 부정확하다. 단백질 정량화를 위한 보다 정확한 분광학적 절차로는 Biuret, Lowry, BCA, Bradford 방법이 있다.

2차원 전기영상을 이용한 정량화

2차원 겔 전기영양증(2-DE)은 장단점이 있는 정량적 프로테오믹스의 주요 기술 중 하나를 나타낸다. 2-DE는 온전한 단백질의 단백질 양, 전하, 질량에 대한 정보를 제공한다. 150kDa보다 크거나 5kDa보다 작은 단백질과 낮은 용해성 단백질의 분석에 한계가 있다. 정량적 MS는 민감도가 높지만 온전한 단백질에 대한 정보를 제공하지 않는다.

후기 전기적 염료 얼룩에 기초한 고전적 2-DE에는 한계가 있다. 재현성을 검증하기 위해서는 최소 3번의 기술적 반복실험이 필요하다.[citation needed] DIGE(Different gel electrophosesis)는 분리 전 단백질의 형광 기반 라벨링을 사용하여 단백질 검출의 감도는 물론 정량화 정밀도를 높였다.[citation needed] 따라서, DIGE는 2-DE 기반 단백질 연구를 위한 현재의 주요 접근방식을 나타낸다.[citation needed]

질량분석을 이용한 정량화

정량적 단백질 워크플로의 예. 빨간색은 생리학적 관심 샘플을 나타내고, 파란색은 대조 검체를 나타낸다. 흰색 상자는 오류가 발생할 가능성이 가장 높은 영역을 나타내고, 보라색 상자는 표본이 혼합된 곳을 나타낸다.[6]

질량분광학(MS)은 장단점을 가진 정량적 단백질학(proteomics)의 주요 기술 중 하나를 나타낸다. 정량적 MS는 민감도가 높지만 온전한 단백질에 대한 제한된 정보만 제공할 수 있다. 정량적 MS는 세포군(벌크 분석)[7] 또는 개별 세포군(단일 세포 분석)에서 전지구적 단백질역학을 이해하기 위해 발견과 표적 단백질 분석 모두에 사용되어 왔다.[8][9]

1990년대에 개발된 초기 접근법은 각각 무거운 동위원소와 가벼운 동위원소가 포함된 시약 2개를 사용하는 동위원소 코딩 선호도 태그(ICAT)와 펩타이드 성분이 함유된 시스틴을 수정하는 바이오틴 친화도 태그를 적용했다. 이 기술은 전체 사카로마이오스 세뇌세포에 라벨을 붙이는 데 사용되어 왔으며, 질량분석과 함께 정량적 프로테오노믹스의 기초를 다지는 데 도움을 주었다.[10] 이 접근방식은 단세포 단백질 분석에도 사용되는 이소바르질량 태그로 대체되었다.[7][11]

상대적 및 절대적 정량화

질량 분광은 주어진 샘플에 있는 많은 펩타이드의 이온화 효율 및/또는 검출 가능성의 차이 때문에 본질적으로 정량적이지 않으며, 이것은 샘플에 있는 단백질의 상대적, 절대적 풍요를 결정하는 방법의 개발에 불을 붙였다.[3] 질량 스펙트럼의 피크 강도는 표본 내 분석물질의 피크 강도의 차이가 여러 표본의 풍부함에 있어 상대적 차이를 정확하게 반영하지만 표본 내 분석물질의 양을 나타내는 좋은 지표는 아니다.

질량 분석에서 안정적 동위원소 라벨링

참고 항목: LC–MS

안정적 동위원소 라벨

라벨이 없는 정량화보다 실험적인 편견에 민감하지는 않지만 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 상대 정량화 접근방식은 질량분광계가 별도의 표본에서 동일한 단백질을 구별할 수 있도록 하는 안정적인 동위원소 라벨을 표본에 부착하는 것이다. 라벨의 한 유형인 동위원소 태그는 질량 스펙트럼에서 라벨이 부착된 단백질 또는 펩타이드의 알려진 질량 이동을 유발하는 단백질 크로스링커에 통합된 안정적 동위원소로 구성된다. 라벨이 다르게 표시된 시료를 조합하여 함께 분석하며, 동위원소 쌍의 피크 강도 차이는 해당 단백질의 풍부함의 차이를 정확하게 반영한다.

동위원소 펩타이드를 사용한 절대 단백질 정량화는 대상 펩타이드의 알려진 합성중량 동위원소 농도를 실험 샘플로 스파이크한 후 LC-MS/MS를 수행한다. 동위원소 라벨을 사용한 상대 정량화와 마찬가지로 동위원소 화학 펩타이드와 MS가 동시에 분석한다. 그러나 상대적 정량화와 달리 실험 샘플에서 대상 펩타이드의 풍부함은 대상 펩타이드의 절대 정량화를 산출하기 위해 미리 결정된 표준 곡선을 사용하여 표준의 초기 농도와 비교된다.

상대적 정량화 방법에는 동위원소 코딩 선호도 태그(ICAT), 이소바르 라벨링(Tandem 질량 태그) 및 상대적 및 절대 정량화를 위한 이소바르 태그(TRAQ), 라벨 없는 정량화 금속 코딩 태그(MeCAT), N-단자 라벨링, 세포 배양(SILAC), 단자 동위원소 라벨링 등이 있다.기판의 opic 라벨링(DALES) 단백질 비율에 대한 신뢰구간에 펩타이드 강도와 펩타이드 측정합의를 통합한 수학적으로 엄격한 접근법이 등장했다.[12]

절대 정량화는 선택된 반응 모니터링(SRM)을 사용하여 수행된다.

금속 코드 태그

참고 항목: 전기식 이온화 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화

메탈코드 태그(Mechal-coded tag) 방식은 화학적 표기를 기본으로 하지만 안정적인 동위원소를 사용하기보다는 매크로사이클링 복합체 내 란타니드 이온을 다르게 사용한다. 정량적 정보는 라벨이 부착된 펩타이드의 유도 결합 플라즈마 MS 측정에서 나온다. 메카트는 소자 질량 분광 ICP-MS와 결합하여 사용할 수 있으며, 이는 메카트 시약으로 묶인 금속을 단백질이나 생체 분자에 대해 처음으로 절대 정량화하는 것이다. 따라서 금속 표준 용액에 의한 외부 보정을 이용하여 단백질의 절대량을 아토몰 범위까지 결정할 수 있다. 멀티플렉스 실험에서 2D 전기영양과 크로마토그래피에 의한 단백질 분리와 호환된다. 단백질 식별 및 상대 정량화는 MALDI-MS/MS와 ESI-MS/MS로 수행할 수 있다.

질량분석기는 동적 범위가 높은 시료에서 저부유 펩타이드를 검출할 수 있는 용량이 제한적이다. 질량 분광기의 제한된 듀티 사이클은 또한 충돌 속도를 제한하며, 결과적으로 과소[13] 샘플링 준비 프로토콜은 실험 편향의 원천을 나타낸다.

세포 배양 시 아미노산을 사용한 안정적 동위원소 라벨링

세포배양(SILAC)에서 아미노산을 포함한 안정적 동위원소 라벨링은 '헤비' C- 또는 N-라벨 아미노산을 단백질에 대사합한 뒤 MS 분석을 하는 방법이다. SILAC는 가볍고 무거운 형태의 필수 아미노산, 리신 또는 아르기닌으로 보충된 전문매체에서 성장하는 세포를 필요로 한다. 중아미노산이 있는 상태에서 실험 조건이 성장하는 동안 가벼운 아미노산을 함유한 매체에서 하나의 세포군이 성장한다. 무겁고 가벼운 아미노산은 세포 단백질 합성을 통해 단백질에 통합된다. 세포 투석 후, 두 조건에서 동일한 양의 단백질이 결합되어 단백질형 소화를 받게 된다. MS 분석용 단백질형 펩타이드 생성에 사용되는 지배적 효소인 트립신이 리신과 아르기닌의 C-terminus에서 갈라지기 때문에 아르기닌과 리신 아미노산이 선택되었다. 트립신 소화를 마친 후, SILAC 매체에서 배양된 세포에서 나오는 모든 촉성 펩타이드에는 적어도 하나의 라벨이 부착된 아미노산이 있을 것이고, 라벨이 부착되지 않은 샘플에서 라벨이 부착된 샘플로 부터 지속적인 질량 이동을 야기할 것이다. 무거운 아미노산과 가벼운 아미노산을 함유한 펩타이드 성분이 화학적으로 동일하기 때문에 역상기둥분할 때 공출되며 MS 분석 과정에서 동시에 검출된다. 상대 단백질 풍부함은 동위원소 구별 펩타이드의 상대 피크 강도에 의해 결정된다.

전통적으로 SILAC의 멀티플렉싱 수준은 이용 가능한 SILAC 동위원소의 수 때문에 제한적이었다. 최근 NeuCode SILAC라는 새로운 기술은 대사 라벨링(최대 4개)으로 달성할 수 있는 멀티플렉싱 수준을 강화했다.[14] NeuCode 아미노산 방법은 SILAC와 유사하지만 라벨링은 중아미노산만을 활용한다는 점에서 차이가 있다. 중아미노산만 사용하면 SILAC에 필요한 아미노산을 100% 통합할 필요가 없다. NeuCode 아미노산의 증가된 멀티플렉싱 능력은 안정적 동위원소 내 여분의 중성자로부터의 질량 결함을 사용함으로써 얻어진다. 그러나 이러한 작은 질량 차이는 고해상도 질량 분광기에서 해결할 필요가 있다.

SILAC의 주요 이점 중 하나는 MS 분석을 위한 샘플 준비 전에 무거운 샘플과 가벼운 샘플이 결합되기 때문에 처리 오류로 인한 정량화 바이어스 수준이 낮다는 것이다. SILAC와 NeuCode SILAC는 단백질 수준의 작은 변화나 실험군 사이의 변환 후 수정을 감지하는 탁월한 기술이다.

이소바르 라벨링

Isobaric 질량 태그(tandem mass tag)는 무겁고 가벼운 동위원소가 함께 용출될 수 있는 질량과 화학적 특성이 동일한 태그다. 모든 질량 태그는 고유한 수의 C 대체물을 가진 질량 리포터, 모든 질량의 질량을 균등하게 만들기 위해 태그의 질량을 균등하게 만드는 질량 노멀라이저, 펩타이드와 교차하는 반응성 매이티로 구성된다. 이러한 태그는 고에너지 CID에 따라 특정 링커 부위에서 클리빙하도록 설계되어 LC-MS/MS로 계량화된 다른 크기의 태그를 산출한다. 세포, 조직 또는 생물학적 유체로부터 준비된 단백질 또는 펩타이드 샘플은 이소바르 질량 태그와 병렬로 라벨링되고 분석을 위해 결합된다. 단백질 정량은 MS/MS 스펙트럼에서 리포터 이온의 강도를 비교함으로써 이루어진다. Three types of tandem mass tags are available with different reactivity: (1) reactive NHS ester which provides high-efficiency, amine-specific labeling (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex and TMT11plex), (2) reactive iodacetyl function group which labels sulfhydryl-(-SH) groups (iodoTMT) and (3) reactive alkoxyamine functional group which provides c카보닐 함유 화합물의 타원형 라벨링(aminoxyTMT).

다른 정량화 기법(예: SILAC, ICAT, Label-free)에 비해 이소바르 라벨링의 주요 이점은 멀티플렉스 기능의 증가와 그에 따른 처리량 잠재력 증가다. 하나의 LC-MS 실행에서 여러 표본을 동시에 결합하고 분석할 수 있기 때문에 여러 데이터 세트를 분석할 필요가 없고 런투런 변동을 제거할 수 있다. 멀티플렉싱은 검체 처리의 변동성을 줄이고, 각 조건의 단백질을 동시에 정량화하여 특수성을 향상시키며, 복수의 검체에 대한 처리 시간을 단축한다. 현재 이용 가능한 이소바르 화학 태그는 최대 11개의 실험 샘플의 동시 분석을 용이하게 한다.

질량분석에서의 무라벨 정량화

주요기사 : 무라벨정량

상대적 정량화를 위한 한 가지 접근방식은 MS에 의해 표본을 별도로 분석하고 스펙트럼을 비교하여 라벨이 없는 전략에서와 같이 한 표본의 펩타이드 풍부도를 측정하는 것이다. 라벨이 없는 정량화는 정량화 패러다임에서 가장 정확하지 않지만, 통계적 검증이 심할 때 또한 저렴하고 신뢰할 수 있다는 것이 일반적으로 인정된다. 라벨이 없는 정량적 프로테오믹스에는 AUC(곡선 아래의 면적)와 스펙트럼 계수의 두 가지 정량 방법이 있다.

라벨이 없는 정량화 방법

AUC는 LC-MS 주행에서 주어진 펩타이드 스펙트럼에 대해 스펙트럼 피크 아래의 영역을 계산하는 방법이다. AUC 피크 측정은 주어진 분석 물질 혼합물의 단백질 농도에 선형 비례한다. 정량화는 특정 보존 시간에 이온의 양을 측정하여 이온 카운트를 통해 달성된다.[15] 원시 데이터의 표준화를 위해서는 재량권이 필요하다.[16] 고해상도 분광기는 데이터 복제가 가능하도록 만들 때 발생하는 문제를 완화할 수 있지만, 데이터 정상화에 관한 작업은 OpenMS, MassView 등의 소프트웨어를 통해 상당 부분 수행할 수 있다.[17]

스펙트럼 계수는 확인된 단백질의 스펙트럼을 계산한 후 어떤 형태의 정상화를 사용하여 표준화한다.[18] 일반적으로 이는 풍부한 펩타이드 질량 선택(MS)을 통해 수행되며, 이 질량 선택(MS)은 분할된 후 MS/MS 스펙트럼을 계산한다.[15] 펩타이드의 복합적인 생리화학성 때문에 단백질 풍부성의 정확한 추정을 위해서는 단백질 첨두의 다중 샘플링이 필요하다. 따라서 MS/MS 실험의 최적화는 지속적인 관심사다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 대안은 높은 충돌 에너지와 낮은 충돌 에너지 사이에서 순환하는 데이터 독립 기술을 사용하는 것이다. 따라서 가능한 모든 전구체 및 제품 이온에 대한 대규모 조사가 수집된다. 그러나 이는 질량 분광 소프트웨어의 전구체 및 제품 이온 간의 연관성 펩타이드 패턴을 인식하고 일치시키는 능력에 의해 제한된다.

적용들

컴퓨터 예측(A)과 SILAC 동위원소-라벨 정량화(B)를 이용한 생쥐의 α와 β 세포의 생리학적 차이의 정량화 작업 흐름(Work Flow)[19]은 α와 β 세포의 생리학적 차이를 나타내는 키나아제 후보 목록이다.

바이오메디컬 어플리케이션

정량적 프로테오믹스는 의학 분야에서 뚜렷한 응용을 가지고 있다. 특히 마약과 바이오마커 발견 분야에서 말이다. LC-MS/MS 기법은 서로 다른 라벨을 부착하고 이러한 방법을 사용하여 단백질을 분리하는 번거로운 성격과 단백질 정량화의 보다 전지구적인 분석으로 인해 Western Blotte나 ELISA와 같은 전통적인 방법들을 극복하기 시작했다. 질량분석법은 변환 후 수정과 같이 단백질 구조의 차이에 더 민감하기 때문에 단백질에 대한 서로 다른 변형을 정량화할 수 있다. 정량적 프로테오믹스는 이러한 문제들을 회피할 수 있으며, 오직 수행되는 순서 정보만 필요로 한다. 단, 민감도 및 분석 시간의 단점은 반드시 고려해야 한다.[20]

마약발견

정량적 프로테오믹스는 약물 발견의 단백질 표적 식별, 단백질 표적 검증, 독성 프로파일링에서 가장 큰 응용을 가지고 있다.[21] 약물 발견은 단백질-단백질 상호작용과 최근에는 화학프로테오믹스라고 불리는 연구 분야인 약물-소형 분자 상호작용을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 따라서 약물과 같은 작은 분자의 부작용을 감시하고 한 약물 표적의 효능과 치료 효과를 다른 약물 표적에 비해 이해하는 데 큰 가능성을 보였다.[22][23] 약물 발견에서 절대 단백질 정량화를 위한 더 전형적인 방법론 중 하나는 다중 반응 모니터링(MRM)과 함께 LC-MS/MS를 사용하는 것이다. 질량 분석은 일반적으로 3중 4중극 MS에 의해 이루어진다.[21]

참고 항목

참조

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