프로모터 때리기

Promoter bashing
Promoter Bashing
가상의 2개 분야 추진자를 때리는 추진자. 그 프로모터는 lacZ 리포터 유전자의 업스트림에서 복제되었다. 각 지역을 불활성화하는 포인트 돌연변이는 (빨간 Xs)로 만들어지고 그 지역을 플라스미드에 복제하여 대장균 세포에 삽입하고 성장하여 리포터의 존재를 측정한다. 이 예에서 단백질 B의 결합은 RNA 중합효소가 결합하고 전사를 시작하기 위해 필요하다.
실험실 환경에서, 발기인이 두 개의 영역으로 구성되어 있는지 모를 수 있다. 즉, 발기인을 따라 단일 돌연변이를 할 수 있고, 발기인을 시퀀싱할 수 있으며, 각 지역의 경계를 찾기 위해 분석된 기자의 수준.

촉진자 때리기란 일반적으로 촉진자인 DNA 가닥의 특정 부위가 하류 유전자의 전사에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 분자생물학에서 사용되는 기법이다. 정상적인 상황에서 단백질은 발기인과 결합하여 전사를 활성화하거나 억제한다. 분석하는 발기인은 특정 지점 변경이나 삭제는 발기인의 특정 영역에서 이루어지며 유전자 전사가 측정된다. 발기인 지역의 기여는 전사 수준으로 관찰할 수 있다. 돌연변이 또는 삭제로 전사 수준이 변경되는 경우, 추진자의 해당 지역이 구속력 있는 사이트 또는 기타 규제 요소일 수 있다고 알려져 있다.[1][2][3]

촉진자 bashing은 종종 DNA 가닥의 5' 또는 3' 끝에서 삭제하는 것으로 행해진다. 이 검사는 반복적인 제한 소화와 특정 크기의 젤 정화하는 파편에 기초하여 수행하기가 더 쉽다. 종종 프로모터를 리포터로 끌어들이고, PCR이나 박테리아의 성장을 이용한 다량의 리포터 구조를 생성한 다음, 이 샘플에 대해 직렬 제한 다이제스트를 수행하는 것이 가장 쉽다. 업스트림 프로모터의 능력은 5의 끝에서 세그먼트를 제거하여 쉽게 파악할 수 있으며, 다운스트림 프로모터의 경우 3의 끝부분도 마찬가지다.[4]

발기인은 일반적으로 전사에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 시퀀스를 포함하고 있기 때문에 발기인의 효과를 시험할 때도 그러한 단백질이 필요하다. 촉진자와 관련된 단백질은 전기영동성 이동성 이동성 검사(EMSA)를 사용하여 식별할 수 있으며, 돌연변이 유발자에 단백질을 포함하거나 배제하는 효과는 분석에서 평가할 수 있다. 이것은 촉진자 때리기의 사용을 통해 전사에 영향을 미치는 DNA 가닥의 위치뿐만 아니라 그 가닥에 영향을 미치는 단백질도 발견할 수 있게 한다. 결합 부위뿐만 아니라 서로 단백질 상호작용의 영향도 이러한 방식으로 분석할 수 있다. 후보 단백질은 EMSA 대신 단백질/단백질 상호작용 측정으로 식별되어야 한다.[5]

절차

이것은 Boulin 등으로부터 각색된, 프로모터 Basking Assay의 예시 절차다.[6]

  1. 촉진자 역할을 하는 것으로 생각되는 DNA 영역을 복제한다. 복제는 촉진자가 표현에 영향을 미치는 유일한 요인이라는 것을 보장하기 때문에 검사에 필요하다. 이 단계는 종종 그것이 살고 있는 유기체로부터 DNA를 추출하고 PCR 증폭을 포함한다.
  2. 지역을 정렬하십시오. DNA 염기서열은 야생형 프로모터와의 돌연변이 촉진자 간의 차이를 식별하고, 그러한 차이를 유전자 발현상의 차이와 연관시키기 위해 필요하다. 게다가, 그것은 그 지역의 제한 소화에 도움이 된다.
  3. 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 소화한다. 그 지역은 추진자의 일부가 아니라고 생각되는 요소들을 제거하기 위해 소화될 수 있다. 또한, 대부분의 프로모터에게는 프로모터로부터 일정한 거리를 두고 리포터 유전자를 삽입해야 한다. 일부 프로모터 강타 방법에서는 여러 제한 요약을 사용하여 프로모터의 요소를 체계적으로 제거한다. 즉, 이 방법은 제거된 프로모터의 지역이 리포터 표현에 기여하지 않도록 보장한다.
  4. 프로모터를 돌연변이화하십시오. 소화제한으로 추진자의 일부를 제거하는 방법을 사용하지 않을 경우 추진자를 변이시킬 필요가 있다. 많은 변형된 가닥들이 생성될 수 있으며, 가닥들이 배열되어 있고 프로모터들의 활동이 분석되었다. 하나의 돌연변이가 바인딩 사이트를 비활성화한다고 보장할 수 없기 때문에 이것은 종종 필요하다. 비방향 PCR 기반 돌연변이 유발도 사용할 수 있다; 돌연변이 PCR 반응의 매개변수를 조정하여 합리적인 수의 돌연변이를 도입할 수 있다. 그러나 PCR의 무작위적 특성은 이 단계의 하류에 더 많은 가닥이 분석되어야 한다.
  5. 리포터 유전자를 찾아라. 검사할 촉진자는 유전자 발현 수준을 측정할 수 있도록 리포터 유전자에 묶어야 한다. 리포터 유전자는 발기인이 야생형 발기인이 유전자에 영향을 미칠 수 있는 충분한 거리여야 한다. 이는 긍정적인 통제(완전한 추진자)를 통해 검증할 수 있다.
  6. 다양한 프로모터:리포터 구조로 관심 셀을 변환하십시오. 발기인과 리포터 구조는 반드시 플라스미드로 묶어서 그 플라스미드를 표현하여 각 발기인의 활동을 측정할 수 있는 세포로 변환해야 한다. 촉진자에게 영향을 미치는 단백질은 또한 세포에 추가되어야 한다. 종종 그러한 단백질은 구성적으로 활동적인 촉진자의 규제에 따라 동일하거나 다른 플라스미드에 배치된다.
  7. 리포터-제네 전사 비율을 측정한다. 유전자 생산물을 분석하여 리포터 전사의 비율을 측정한다.

서로 다른 프로모터들을 평가하여 받은 데이터로부터 프로모터의 다양한 부분의 효과를 확인할 수 있다. 그러나 데이터가 충분하지 않을 수 있으며 다른 프로모터 지역 및/또는 다른 돌연변이로 검사를 다시 실행해야 한다.

참고 항목

참조

  1. ^ 캄비셀리스, M. (2003) 계산 분자 유전체학: 유전자, 조절, 진화. (박사학위 논문). http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html에서 검색됨
  2. ^ Chalfie, M, & Kain, S.(2005) 생물학적 분석 방법, 녹색 형광 단백질: 특성, 응용 및 프로토콜 와일리
  3. ^ 마쓰쿠라, S, 스텔라토, C, 플리트, J. R, 비켈, C, 미우라, K, 조라스, S. N, 카솔라로, V, 슐레이머, R. P. (1999년) "휴먼 기도상피세포에서 NF-148B와 STAT6에 의한 Eotaxin Gene Transscription 활성화" J 이문올 163:6876-6883. PMID 10586089.
  4. ^ Engstrom, E. M., 이즈하키, A., Bowman, J. L. (2004) "프로모터 때리기, 마이크로RNA, 녹스 유전자. 아라비도피스에서의 횡적 장기 극성 확립에 대한 새로운 통찰력, 규제자, 규제 대상." 식물 피시올 135(2): 685-94. 도이: 10.1104/pp.104.040394. PMID 15208415. PMC 514105.
  5. ^ 궈, y, xu, xu, xu, mao, mao, q, fu, fu, j, zhu, zhu, J. 2002, J. D. (2002) "신기 염색체 17p13.3 유전자인 인간 C17orf25 유전자의 촉진자 분석" Cell Research 12:339-352. doi:10.1038/sj.cr.7290136.
  6. ^ 불린, T. 외 리포터 유전자 퓨전스(2006년 4월 5일), 웜북, 에드. C.선충 연구 공동체 웜북 doi 10.168.1, http://www.wormbook.org.