다이버시티 어레이 기술

Diversity arrays technology

다이버시티 어레이 기술(DART)은 유전형성 및 기타 유전자 분석을 위한 DNA 시퀀스 정보 없이도 포괄적인 게놈 커버리지를 제공하기 위해 알레르기의 변이를 탐지할 수 있는 고투과 유전자 표식 기법이다.[1][2][3]일반적인 단계에는 특정 제한 효소로 게놈 DNA의 복잡성을 줄이고, 부모 게놈의 표현으로 사용할 다양한 파편을 선택하며, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭시키고, 파편을 벡터에 삽입하여 마이크로 어레이 내의 프로브로 배치한 다음, 기준 시퀀스에서 형광 표적을 포함한다.탐침과 혼합되어 영상 시스템을 통과하도록 허용될 것이다.[1][2]목표는 샘플링된 종의 유전체 DNA 내에서 다양한 형태의 DNA 다형성을 식별하고 정량화하는 것이다.[1]

Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein, Kaiman Peng에 의해 2001년에 처음 보고된 DArT는 적은 양의 초기 DNA로부터 많은 양의 다양한 샘플을 분석할 수 있는 능력과 같은 다른 전통적인 프라이머 기반 방법보다 중요한 이점을 우선시했다.[1][2][4][5]또한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출한 관련 솔리드 스테이트 DNA 어레이에 비해 낮은 비용과 빠른 결과를 제공했다.[1][2]이 기술은 창시 이래 폴리플로이드 식물의 분석은 물론, 유전체 간의 유사성과 대립 분산을 바탕으로 종과 관련된 것을 이해하기 위한 물리적, 유전적 지도 구축에도 주요한 도구가 되어 왔다.[1][2][6][7][8][3]

역사

이 개념은 2001년 데미안 자쿠드, 안드르제즈 킬리안, 데이비드 파인스타인, 카이만 펭에 의해 처음 개발되었다.[1]그들은 증폭된 파편 길이 다형성(AFP), 제한 파편 길이 다형성(RFLP), 단순 시퀀스 반복(SSR)과 같은 전통적인 방법에 비해 처리량을 증가시키는 유전체 DNA 다형성 검출 및 정량화 기법을 확립하는 것을 목표로 했다.[1][2][4][5]그들은 또한 SNP를 단독으로 식별하는 DNA 칩과 같이 초기에 고정되고 고체 상태의 DNA 배열의 결과인 다형성을 식별하기 위해 염가와 염기서열화된 게놈에 대한 의존도를 최소화하는 것을 목표로 했다.[1][2]그들이 빠르고 저렴한 전유전자 프로파일링 방법을 발견함으로써 얻은 부산물은 SNP의 식별뿐만 아니라 분석된 종들 간의 알레르기가 변동의 추가 층인 베이스 페어 삽입, 삭제, 교대조도 제공했다는 것이다.[1][2]

자쿠드, 킬리안, 파인스타인, 펭은 유전자 DNA와 다형성 분석을 위한 원천으로 쌀의 9개 아종을 선택했다.[1]분석은 프로빙 배열을 가진 특정 DNA 다형성의 존재 또는 부재를 탐지하고 아종 내에서 형광을 통해 각 신호의 강도를 정량화하는 것으로 구성되었다.피험자에게서 DNA 샘플을 골라 추출한 결과, 샘플은 세 가지 특정 제한 효소로 소화되고 T4 리가아제로 묶였다.이중 좌초된 DNA로 감싼 후 희석 및 PCR 템플릿으로 사용할 짧은 양의 혼합물 추출이 수행되었다.제품들은 pCR2.1-TOPO 벡터에 배치되었고 이후 대장균으로 변형되었는데, 이들은 X-gal 상호작용에서 앰피실린과 색소침착에 대한 저항성을 바탕으로 선택되었다.[1][2]복제된 세포는 PCR로 증폭, 정제, 마이크로 어레이로 도입된다.참조 DNA와 샘플은 형광 염료, Cy3 또는 Cy5와 혼합되어 혼합, 변성, 혼합이 가능했으며, 추가 분석을 위해 이들을 마이크로 어레이에 추가적으로 재도입할 수 있도록 허용했다.결과는 DArT를 사용함으로써 검출된 다형성을 계량화함은 물론, RFLP에 비하여 다형성의 유무를 편법적으로 검출할 수 있었다고 보고했다.[1]또한 DArT는 다른 방법에 비해 분석을 수행하는 데 필요한 초기 DNA 양을 최소화할 수 있었다.[1]

절차

DArT는 복잡성 감소, 게놈 표현, DArT 분석의 세 가지 필수 단계로 구분된다.[2]

복잡성 감소

이 프로세스의 이 단계는 특정 제한 효소의 사용을 통해 선별된 종의 대규모 복합 유전체 DNA를 보다 관리 가능한 파편화된 성분으로 감소시키는 것을 다룬다.또한 이 단계는 분석된 샘플에서 확인된 보고된 다형성 증가 때문에 소화 효소와 프라이머의 두 가지 노력보다 소화 효소에 전적으로 의존한다.[2]PstI 효소는 종의 비반복성, 비메틸화 게놈에 대한 특수성 때문에 이 단계에서 흔히 사용되는 제한 효소다.[2][6][7][8][9]

게놈 표현

한 두 개의 특정 제한 효소를 통합하여 유전체 DNA가 이전 단계보다 관리 가능한 크기로 줄어들면, 다음 단계에서는 유전자 풀 전체에서 가장 많은 양의 유의한 다형성을 포함하는 파편을 선택하는 것이 포함된다.이 선택된 파편들은 초기, 더 큰 유전체 DNA의 작은 표현이기 때문에 "표현"이라고 불린다.분석된 유전체 DNA 내에서 가장 낮은 다형성을 보일 것이기 때문에 파편을 선택할 때 반복적인 시퀀스를 피하는 것이 중요하다.[2]

DART 검사

소화된 염기서열은 T4 리가제를 이용해 묶어서 이중으로 좌초된 DNA를 생성한다.소량의 결합 혼합물은 희석된 후 PCR을 통해 증폭될 것이다.PCR 중에는 거의 억제되지 않는 제한효소 절단부위 및 RedTaq 중합효소(RedTaq polyerase)에 프리머를 사용하는 것이 중요하다.증폭된 유전자 풀 표현에 제품을 혼합한 후 벡터 PCR2.1-TOPO로 이동시킨다.벡터에 표현을 삽입한 후 전기 충격 또는 화학적 수단을 통해 벡터를 대장균 세포로 변환한다.세포를 배양하고 X-gal이 함유된 매질에서 비활성 β-갈락토시다아제 유전자의 앰피실린 저항성과 백색피그먼트를 기반으로 선택한다.[1][2]그런 다음 PCR을 통해 삽입물이 증폭되어 마이크로 어레이 슬라이드에 스폿터로 삽입된다.슬라이드는 삽입물을 분리하기 위한 원심분리기로, 이후 정화된다.

형광 염료인 Cy3 또는 Cy5는 유전학적 표현인 마이크로 배열 대상에 추가된다.형광 염료에 이어 증폭된 대장균 클론을 포함하는 마이크로 어레이 탐침에 표적을 추가해 변성 및 후속 혼합이 가능하다.하이브리드화에 이어, DArTsoft라는 오픈소스 소프트웨어를 통합하여 형광 신호를 표적으로 하는 영상 시스템으로 슬라이드를 세척하고 스캔한다.프로브와 다양한 표적 사이의 상호작용과 차이점은 분석된 게놈들 사이에서 DNA 다형성의 여러 형태를 정량화하고 식별하는 히스토그램을 개발하는 데 사용된다.[1][2]

적용들

분자 번식

염기서열화된 게놈의 필요 없이 게놈들 간의 알레르기의 변이를 식별하고 정량화하는 능력은 DArT에 큰 가치가 있으며 분자 번식 분야에서도 큰 시사점을 갖고 있다.[1][2]특정 환경 기생충에 대한 높은 생산량이나 저항성 등 표현형과 농작물을 비교함으로써 표현형은 DArT를 통해 관련 종에서 확인된 DNA 다형성과 직접 연결될 수 있다. 또한 DArT는 o에서 프라이머 경쟁이 발견되지 않아 폴리플로이드로 다른 유전자형 기법을 능가할 수 있다.그들의 [2]기술폴리플로이드는 농업적으로 중요한 작물들 사이에서 흔히 발견된다.[2]예를 들어, DArT는 바나나와 식물을 포함하는 무사 종 중에서 게놈전역 분석을 실시하는데 사용되어 왔으며, 이로 인해 DArT 기법에서 파생된 유전자 표지를 기반으로 한 혈전학 클래도그램이 개발되었다.이러한 발전은 바람직한 수확량과 생산물을 얻기 위해 사육 지식을 강화한다.[3]

표현형을 담당하는 유전자를 가지고 발견된 표지의 신속한 인식은 DArT의 도움으로 동물에서도 연구되고 있다.[2][10]모기의 살충제에 대한 저항은 특정 종의 모기에 다른 종에 대한 저항력을 부여하는 유전자의 특정한 돌연변이와 연관되어 왔다.[10]관련 샘플에 대한 DArT 분석을 수행하는 동안 마커를 통해 유전자형 변형이 발견되었다.

게놈 매핑

DArT는 메타게놈 내 종들 간의 유전적 관계를 저렴하고 신속하게 찾을 수 있기 때문에 밀접하게 연관된 종들의 물리적, 유전적 지도를 개발하는 데 필수적이었다.[2][8]DArT는 초기에는 각 종의 게놈에 DNA 파편이 존재하거나 존재하지 않는 것을 바탕으로 쌀 아종의 계통학 클래도그램 개발에 사용되었다.[1]같은 방식으로 DArT는 자동화된 DArT 버전을 실시하여 A. thaliana의 유전자 지도를 제작하는 데 통합되었다.[2][9]육각류인 밀도 역시 가장 큰 염색체 3B의 박테리아 인공염색체(BAC)가 DART 검사를 통해 검출된 마커에서 생성돼 DART 분석을 시행해 이득을 본 또 다른 작물이다.[8][11]

참조

  1. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (February 2001). "Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping". Nucleic Acids Research. 29 (4): 25e–25. doi:10.1093/nar/29.4.e25. PMC 29632. PMID 11160945.
  2. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u Kilian A, Wenzl P, Huttner E, Carling J, Xia L, Blois H, et al. (2012). "Diversity arrays technology: a generic genome profiling technology on open platforms". In Pompanon F, Bonin A (eds.). Data Production and Analysis in Population Genomics. Methods in Molecular Biology. Vol. 888. Totowa, NJ: Humana Press. pp. 67–89. doi:10.1007/978-1-61779-870-2_5. ISBN 978-1-61779-870-2. PMID 22665276. Data Production and Analysis in Population Genomics: Methods and Protocols
  3. ^ a b c Risterucci AM, Hippolyte I, Perrier X, Xia L, Caig V, Evers M, et al. (October 2009). "Development and assessment of Diversity Arrays Technology for high-throughput DNA analyses in Musa". TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische und Angewandte Genetik. 119 (6): 1093–1103. doi:10.1007/s00122-009-1111-5. PMID 19693484. S2CID 23747800.
  4. ^ a b Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, et al. (November 1995). "AFLP: a new technique for DNA fingerprinting". Nucleic Acids Research. 23 (21): 4407–4414. doi:10.1093/nar/23.21.4407. PMC 307397. PMID 7501463.
  5. ^ a b Weber JL, May PE (March 1989). "Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction". American Journal of Human Genetics. 44 (3): 388–396. PMC 1715443. PMID 2916582.
  6. ^ a b Rabinowicz PD, Schutz K, Dedhia N, Yordan C, Parnell LD, Stein L, et al. (November 1999). "Differential methylation of genes and retrotransposons facilitates shotgun sequencing of the maize genome". Nature Genetics. 23 (3): 305–308. doi:10.1038/15479. PMID 10545948. S2CID 19943394.
  7. ^ a b Wenzl P, Carling J, Kudrna D, Jaccoud D, Huttner E, Kleinhofs A, Kilian A (June 2004). "Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling of barley". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26): 9915–9920. Bibcode:2004PNAS..101.9915W. doi:10.1073/pnas.0401076101. PMC 470773. PMID 15192146.
  8. ^ a b c d Akbari M, Wenzl P, Caig V, Carling J, Xia L, Yang S, et al. (November 2006). "Diversity arrays technology (DArT) for high-throughput profiling of the hexaploid wheat genome". TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische und Angewandte Genetik. 113 (8): 1409–1420. doi:10.1007/s00122-006-0365-4. PMID 17033786. S2CID 12636193.
  9. ^ a b Wittenberg AH, van der Lee T, Cayla C, Kilian A, Visser RG, Schouten HJ (August 2005). "Validation of the high-throughput marker technology DArT using the model plant Arabidopsis thaliana". Molecular Genetics and Genomics. 274 (1): 30–39. doi:10.1007/s00438-005-1145-6. PMID 15937704. S2CID 34817585.
  10. ^ a b Bonin A, Paris M, Després L, Tetreau G, David JP, Kilian A (October 2008). "A MITE-based genotyping method to reveal hundreds of DNA polymorphisms in an animal genome after a few generations of artificial selection". BMC Genomics. 9 (1): 459. doi:10.1186/1471-2164-9-459. PMC 2579443. PMID 18837997.
  11. ^ Paux E, Sourdille P, Salse J, Saintenac C, Choulet F, Leroy P, et al. (October 2008). "A physical map of the 1-gigabase bread wheat chromosome 3B". Science. 322 (5898): 101–104. Bibcode:2008Sci...322..101P. doi:10.1126/science.1161847. PMID 18832645. S2CID 27686615.


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