델리토 페페토

Delitto perfetto

델리토(Delitto perfetto)(이탈리아어: [deittlitto perɛftotto])는 효모에 들어 있는 생체내 부위별 돌연변이 유발에 대한 유전적 기법이다.이 이름은 '완벽한 살인'을 뜻하는 이탈리아어로 게놈에 외국 DNA를 하나도 남기지 않고 원하는 유전적 변화를 만들어낼 수 있는 기법의 능력을 가리킨다.

배경

이 기술은 Michael A로 구성된 국립환경보건과학원(NIEHS)의 한 단체가 개발했다.레스닉, 프란체스카 스토리치(현 조지아공대), L. 케빈 루이스(현 사우스웨스트텍사스 주립대).이 방법은 합성 올리고뉴클레오티드를 동질 재조합의 세포 과정과 결합하여 사용한다.결과적으로, 그것은 매우 효율적인 동음이의 재조합을 가지고 있는 효모의 유전자 조작에 잘 적합하다.delitto perfetto 접근법은 단일 및 복수 점 돌연변이, 유전자 절단 또는 삽입, 전체 유전자 삭제(필수 유전자 포함)를 생성하는 데 사용되어 왔다.

이점

이 기술의 가장 큰 장점은 돌연변이 유발 과정 후에 게놈에서 어떤 외래 DNA도 제거할 수 있다는 것이다.이렇게 하면 게놈의 왼쪽을 목표로 하는 데 사용할 수 있는 선택 가능한 마커나 외생적 시퀀스가 전혀 없어 예기치 못한 영향을 미칠 수 있다.

또한 델리토 관류 기술은 생체내 사이트 유도 돌연변이 유발에 대한 다른 방법에 비해 간단하다.다른 방법으로는 돌연변이 유발 여부를 확인하기 위한 다중 복제 단계와 광범위한 DNA 염기서열이 필요하며, 이는 종종 복잡하고 비효율적인 과정이다.[1][2][3]

CORE 카세트를 삽입한 후(자세한 내용은 Method Overview(방법 개요) 참조) 관심 유전자의 다중 돌연변이를 쉽고 빠르게 만들 수 있기 때문에 이 접근방식은 매우 유연하다.

이 방법은 이끼의 물리적 결합, DT40 닭 세포 또는 대장균과 같이 균질 재조합이 효율적인 다른 유기체에 적용할 수 있다.또한 인간의 유전자는 효모 인공 염색체(YACs)를 사용하여 효모에서 연구될 수 있으며 이와 유사하게 유전적으로 조작될 수 있다.

단점들

delitto perfetto 기술은 동질 재조합에 기초하므로, 이 과정이 효과가 있으려면 세포에서 기능해야 한다.사카로마이오스 세레비시아에 있어서 RAD52 유전자는 동질 재조합에 필수적이므로 델리토 관류법(delitto perfetto method)에 필요하다.

이 방법은 선택 가능한 마커가 필요하지 않은 응용 프로그램에만 유용하다.예를 들어 돌연변이 효모 균주는 테트라드 분석과 같은 추가 유전자 분석에 사용할 수 없다.마커는 별도의 프로세스에서 적절한 위치에 삽입해야 한다.

기술적 단점

  • 올리고뉴클레오티드 비용
  • 뮤타게네시스(Mutagenesis)는 삽입된 카세트를 둘러싼 게놈 영역으로 제한된다.
  • 리포터 유전자 수가 제한됨(사용 가능한 CORE 카세트에 의해 제한됨)
  • 특정 용도에 대한 낮은 효율성(예: 필수 유전자 삭제)

방법 개요

Delitto Perfetto는 생체내 돌연변이 유발에 대한 2단계 방법이다.초기 단계에서 CORE 카세트를 호몰로 재조합하여 관심 영역에 삽입한다.이후 CORE 카세트를 관심의 돌연변이를 포함하는 DNA로 대체한다.

그림 1. 델리토 페페토용 코어 카세트용 코어 카세트

코어 카세트

CORE 카세트에는 COUNter 선택 가능한 마커와 REPORTER 유전자가 모두 포함되어 있다.리포터 유전자는 프로세스의 첫 단계 동안 CORE 카세트를 받는 효모세포의 선택을 허용한다.역선택 가능한 마커는 프로세스의 두 번째 단계에서 돌연변이된 올리고뉴클레오티드의 통합에 의해 CORE 카세트를 분실한 효모세포의 선택을 가능하게 한다.

선택할 수 있는 다양한 CORE 카세트가 있는데, 여기에는 다양한 리포터 유전자와 역선택 가능한 메이커, 그리고 추가적인 특징들이 포함되어 있다.[4]

리포터유전자

  • KanMX4 – Genein을 포함한 미디어의 성장 허용
  • hyg – Hygromycin B를 포함하는 매체에서 성장을 허용한다.

역선택 가능한 마커

  • KlURA3 – 5-불화탄산을 함유한 매체의 성장을 방지한다.
  • GAL1/10-p53 – 갈락토스를 함유한 매체에서 성장을 방지한다.그것은 GAL1 프로모터 밑에 p53의 독성 돌연변이를 암호화한다.[5]

추가 기능

  • GAL1-I-SceI – 디플로이드 세포에서 코어 카세트 함유 염색체를 대상으로 하는 효율 증가.그것은 GAL1 추진자 및 SceI 목표 순서에 따른 제한 Endonuclease SceI를 포함한다.[6][7]
그림 2.유전자 삭제를 위한 Delitto Perfetto 개요

기술 워크플로우

먼저 CORE 카세트는 PCR에 의해 삽입될 염색체 부위로 동질학 영역을 포함하는 프라이머로 증폭된다.CORE 카세트는 균질 재조합을 통해 통합된다.CORE 카세트가 들어 있는 셀은 리포터 유전자를 사용하기 위해 선택할 수 있으며, 역선택 가능한 마커를 사용하여 추가로 확인할 수 있다.정확한 염색체 위치에 있는 CORE 카세트의 통합은 500–1500bp 파편을 생성하도록 설계된 통합 크기의 CORE와 다운스트림 내의 통합 현장의 상류에 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 확인할 수 있다.[4]

CORE 함유 효모세포는 호몰로 재조합 시 CORE 카세트의 상실로 이어지는 바람직한 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 변형된다.변환제는 역선택 가능한 마커를 사용하여 선택되며 리포터 유전자를 사용하여 추가로 선별할 수 있다.시퀀싱은 추가 돌연변이 없이 올바른 돌연변이가 생성되었는지 확인하는 데 사용된다.또는 돌연변이가 제한 사이트의 생성 또는 상실로 이어지는 경우, PCR에 이어 제한 다이제스트까지 사용하여 원하는 돌연변이가 통합되었는지 확인할 수 있다.[4]

DSB(Double Strand Break) 매개 델리토 관류토

CORE 카세트를 목표로 하는 올리고뉴클레오티드를 증가시키기 위해 GAL1-I-SceI 기능이 포함된 CORE 카세트를 사용할 수 있다.이 특성은 S. 세레비시아 게놈의 다른 어디에서도 일어날 것 같지 않은 매우 독특한 18개의 뉴클레오티드 염기서열을 인식하는 엔도누실제인 SceI의 발현을 허용한다.SceI Endonuclease는 DNA 수리 기계의 모집으로 이어지는 SceI 사이트에서 DSB를 생성할 수 있다.[8]이는 DSB가 생성되지 않을 때와 비교하여 대상 동질 재조합 빈도를 4,000배 증가시킨다.[6]

올리고뉴클레오티드 설계에 대한 일반적인 고려사항

80–100 bp 올리고뉴클레오티드는 완전히 겹치거나 부분적으로 겹치는 단일 분자, 또는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드로 생성될 수 있다.권장되는 올리고뉴클레오티드 유형은 돌연변이의 유형과 CORE 카세트 통합 사이트에서의 돌연변이가 원하는 거리에 따라 달라진다.

과두핵화물이 길어지면 변환 효율이 높아진다.완전보완성 올리고뉴클레오티드 쌍은 단일 올리고뉴클레오티드 대비 효율이 5~10배 증가하며 모든 용도에 권장된다.[4][9]단, CORE 카세트에서 20–40 베이스의 돌연변이 유발의 작은 창을 제공한다.돌연변이 유발 창을 늘리기 위해 20bp 겹치는 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용할 수 있으며, 이를 통해 코어 통합 사이트의 업스트림과 다운스트림에서 최대 100bp까지 표적이 가능하다.하지만, 그것들은 약 6배 덜 효율적으로 변한다.효율을 높이기 위해 부분적으로 겹치는 올리고뉴클레오티드를 체외에서 확장할 수 있다.[9]

유전자 삭제용

업스트림 바로 다음에 녹아웃될 지역의 다운스트림 순서가 포함된 올리고뉴클레오티드가 설계된다.유전자 삭제의 경우 80–100 bp 올리고뉴클레오티드의 쌍은 단일 올리고뉴클레오티드에 비해 변환 효율이 5~10배 향상된다.[4]

점 돌연변이의 경우

CORE 카세트에서 20 ~ 40 bp의 돌연변이에 대해서는 완전히 중첩된 80–100 bp의 올리고뉴클레오티드가 권장된다.CORE 카세트에서 40bp 이상의 돌연변이의 경우 부분적으로 겹치는 올리고뉴클레오티드를 사용해야 한다.이들의 변환 효율을 높이기 위해서는 부분적으로 겹치는 올리고뉴클레오티드를 체외에서 연장하는 것이 좋다.[4][6][9]

필수 유전자를 위해

필수 유전자의 돌연변이를 생성하기 위해 CORE 카세트를 관심 유전자의 하류에 삽입할 수 있지만, 이는 돌연변이가 가능한 유전자의 영역을 제한한다.대신, 디플로이드 세포를 사용할 수 있다.그러나, 디플로이드를 사용하면 올리고뉴클레오티드가 재결합할 수 있는 두 개의 적절한 염색체 위치가 존재하기 때문에 올리고뉴클레오티드의 타겟팅 효율이 감소한다.이러한 단점을 해결하기 위해 DSB 매개 델리토 관류 방법을 사용할 수 있다.이는 DSB가 생성되지 않을 때와 비교하여 대상 동질 재조합 빈도를 700배 증가시킨다.게다가, 그것은 이용 가능한 다른 방법들에 비해 2-5배 더 효율적이다.[6][9]

백그라운드 돌연변이

이중 좌초된 균열이 발생하지 않을 때 표적형 올리고뉴클레오티드가 없을 때 CORE 카세트를 분실한 세포 수는 10개7 실행 가능한 세포당 1개 미만의 변환제인 것으로 알려졌다.이와는 대조적으로, 이 숫자는 이중 좌초된 균열이 발생할 때 10개의7 실행 가능한 세포당 100개까지 증가한다.디플로이드에서, 증가된 배경 돌연변이 비율은 동질 염색체와의 동질 재결합으로 인해 표적 변환 사건을 전체 변환체의 4%로 감소시킴으로써 발생한다.[6]

참조

  1. ^ Erdeniz N, Mortensen UH, Rothstein R. (1997) 복제 없는 PCR 기반 알레르 교체 방법.게놈 레즈 7:1174-83.
  2. ^ Langle-Rouault F, Jacobs E. (1995) 재활용 가능한 선택 가능한 마커를 사용하여 효모 게놈에서 정밀한 수정을 수행하는 방법.핵산 자원 23:3079-81.
  3. ^ Scherer S, Davis RW. (1979) 체외에서 생성된 변경된 DNA 시퀀스로 염색체 세그먼트를 대체한다.Natl Acad Sci 76:4951-5.
  4. ^ a b c d e f Storici F, Resnick MA. (2006) 효모에서 합성 올리고뉴클레오티드를 가진 체내 유도 돌연변이 유발 및 염색체 재배치에 대한 델리토 관류 접근.메소드 에지몰.409:329-45.
  5. ^ 인가 A, 레스닉 MA. (2001) 효모에 독성이 있는 인간 p53 돌연변이는 특정 촉진제 및 반응성 종양 p53 돌연변이의 불활성화를 강화할 수 있다.종양. 14;20(27):3573-9
  6. ^ a b c d e Storici F, Durham CL, Gordenin DA, Resnick MA.(2003) 염색체 부위별 이중 스트랜드 파손은 효모 내 올리고뉴클레오티드에 의한 수리를 효율적으로 목표로 한다.Proc Natl Acad Sci. 9;100(25):14994-9
  7. ^ Plessis A, Perrin A, Haber JE, Dujon B. (1992) 효모 핵에 표현된 미토콘드리아 그룹 I 인트론 인코딩 엔도누클리스 I-SceI에 의해 결정된 현장 고유 재조합.유전학. 130(3:451-60)
  8. ^ 스토리치 F, 레스닉 MA. (2003) 델리토 피페토는 올리고뉴클레오티드가 있는 효모 속의 돌연변이 유발균을 목표로 삼았다.지네테엥. 25:189-207
  9. ^ a b c d 스토리치 F, 루이스 LK, 레스닉 MA. (2001) 올리고뉴클레오티드를 이용한 인바이오 사이트 지시 돌연변이 유발 물질.나트 바이오테크놀. 19(8):773-6