단일 분자 자기 시퀀스 처리

Single-molecule magnetic sequencing

자기 시퀀싱은 개발 중인 단일 분자 시퀀싱 방법입니다.관심 시퀀스를 포함한 DNA 헤어핀은 자기 비드와 유리 표면 사이에 결합되어 있다.자기장을 인가하여 헤어핀을 1가닥으로 연신하고, 그 자기장을 감소시킨 후 헤어핀을 리폴드한다.헤어핀 길이는 간단한 현미경을 사용하여 자기 비드의 회절 링을 직접 촬영하여 확인할 수 있습니다.DNA 배열은 상보적인 뉴클레오티드의 [1]성공적인 교배 후 헤어핀 길이의 변화를 측정하여 결정됩니다.

단일 분자 시퀀싱과차세대 시퀀싱

다양한 차세대 염기서열처리 플랫폼이 개발됨에 따라 비용이 대폭 절감되고 DNA 염기서열처리 처리량도 향상되었습니다.그러나 대부분의 배열 기술은 신호를 검출 가능한 [2]범위로 만들기 위해 DNA 분자의 PCR 기반 복제 증폭에 의존합니다.증폭된 클러스터의 시퀀스 또는 이러한 클러스터에서의 벌크 시퀀싱은 읽기 길이에 의존하는 페이징 문제를 제기합니다.각 주기 동안, 벌크 내의 모든 분자가 추가적인 뉴클레오티드를 성공적으로 포함시키는 것은 아니다.시퀀싱 사이클이 증가하면 지연된 분자의 신호가 결국 진정한 신호를 압도하게 됩니다.페이징 문제는 차세대 시퀀싱 기술의 읽기 길이에 대한 주요 제한 사항입니다.따라서 증폭이 필요 없는 단일 분자 배열 기술 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다.이는 시퀀싱 라이브러리의 준비 시간을 단축할 뿐만 아니라 확장 실패의 지연 분자를 무시하거나 별도로 고려할 수 있기 때문에 훨씬 더 긴 읽기 길이를 달성할 가능성이 있습니다.기존에 알려진 단일 분자 배열 기술에는 나노포어 배열 기술(Oxford Nanopore),[3] SMRT 배열 기술(Pacific Biosciences)[4] 및 헬리스코프 단일 분자 배열 기술(Helicos Biosciences)[5]이 있습니다.

DNA 헤어핀과 교배된 올리고뉴클레오티드의 자기 검출

자기 비드와 유리 슬라이드에 부착된 DNA 헤어핀
잡종 현상으로 인한 DNA 헤어핀 리폴딩의 일시적인 차단

DNA 헤어핀 생성

관심 있는 DNA 분자는 머리핀에 통합되어 한쪽 끝은 자기 비드에, 다른 한쪽 끝은 움직이지 않는 유리 표면에 부착되어야 합니다.헤어핀은 디옥시게닌-안티디옥시게닌 [1]결합을 통해 유리 표면에 부착됩니다.자기 비드는 비오틴-스트렙타비딘 [1]상호작용을 통해 반대쪽 끝에 부착됩니다.이러한 DNA 헤어핀 설정은 다음 두 가지 방법으로 할 수 있습니다.

1) 2가닥 DNA 분자(전체 게놈 배열 또는 표적 배열용)의 경우, 한쪽 끝은 DNA 루프, 양쪽 끝은 [1]비오틴 및 디옥시게닌으로 표시된 DNA 포크 구조에 DNA 단편을 결합한다.
2) RNA-seq는 mRNA를 폴리-T 코팅 비즈에 포착할 수 있으며, 이 비즈에 역전사 반응을 일으켜 cDNA [1]헤어핀을 생성한다.

머리핀 길이 측정

샘플 슬라이드 [6]위에는 전자석이 배치되고 아래에는 [7]역현미경이 배치됩니다.이미지는 CCD 카메라를 통해 캡처되고 컴퓨터로 전송되며, 여기서 자기 비드의 3차원 위치가 결정됩니다.유리 슬라이드의 수평면 내 비드의 위치 x와 y는 비드 [8]이미지의 실시간 상관관계에 의해 결정됩니다.부착된 자기 비드의 수직 위치에 의해 측정된 헤어핀의 수직 길이는 비드의 회절 링 직경으로 측정되며,[7] 이 직경은 거리에 따라 증가합니다.

DNA 헤어핀 개폐

DNA 헤어핀의 지퍼를 내리기 위해 일정한 자력이 작용하며, 이 힘을 줄이면 헤어핀이 다시 [9]지퍼링할 수 있습니다.다운스트림애플리케이션을 실행하기 전에 몇 가지 압축 해제 및 리지핑 사이클이 실행됩니다.압축 해제 및 재압축에 필요한 자력은 DNA 시퀀스 및 헤어핀 길이에 따라 달라질 수 있지만 시퀀스 실행 내에서 일관되는 [1]한 절대값은 중요하지 않습니다.

하이브리드 이벤트 검출

DNA 헤어핀이 단일 가닥으로 압축 해제되면 헤어핀 배열에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 교배될 수 있다.리지핑 과정의 시간 과정 동안 결합 올리고뉴클레오티드는 일시적인 [1]폐색을 일으킨다.헤어핀 길이의 타임코스 측정을 통해 올리고뉴클레오티드와 [1]헤어핀 사이에 불일치가 있을 뿐만 아니라 교잡의 정확한 위치를 결정할 수 있습니다.

시퀀싱에서 머리핀 길이 검출을 위한 응용 프로그램

하이브리드화에 의한 시퀀싱

하이브리드화에 의한 자기 시퀀싱과 관련된 단계
참고 항목: 하이브리드화에 의한 순서 지정

잡종은 머리핀 길이의 변화를 감지하는 것으로부터 DNA 가닥의 순서를 결정하는 한 가지 방법입니다.프로브가 열린 헤어핀으로 하이브리드되면 헤어핀의 완전한 리폴딩이 정지되고 하이브리드 프로브의 위치를 유추할 수 있습니다.따라서 [10]관심 있는 DNA 조각의 시퀀스는 하나씩 교배할 수 있는 프로브 세트의 위치를 겹침으로써 추론할 수 있습니다.

8-nt 시퀀스 생성

우선 DNA 단편을 각각의 원래 뉴클레오티드가 특정 8nt 배열(A8, T8, G8 및 C8)[11]로 부호화된 새로운 배열로 변환하여 헤어핀에 결합할 수 있다.

A8, T8, C8, G8 올리고뉴클레오티드의 교배

자력을 가한 후 헤어핀의 지퍼가 없는 상태에서 소수의 식별 뉴클레오티드가 헤어핀 상의 새로운 개별 상보적 배열에 교배할 수 있어 일시적으로 헤어핀의 리폴딩을 차단할 수 있다.

지도 위치

식별뉴클레오티드의 혼성화에 의해 발생하는 헤어핀의 폐색위치의 식별은 헤어핀 거리 측정의 시간코스에서의 일시정지로서 관찰할 수 있다.겹치는 조각으로 전체 시퀀스를 재구성할 수 있습니다.

결찰에 의한 시퀀싱

결찰에 의한 자기 시퀀싱과 관련된 단계
참조 항목: 바리에이션에 의한 순서 지정

자기 시퀀싱의 또 다른 응용은 머리핀 단대단 거리를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 [12]연속적인 결속을 검출하는 것이다.결찰에 의한 배열의 첫 번째 단계는 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 확장하는 것입니다.먼저 아데닌으로 시작하는 단편으로 확장을 시도하는데, 아데닌은 반대편 가닥의 다음 뉴클레오티드가 티민일 때만 결합될 수 있다.그런 다음 시토신, 구아닌, 티민으로 시작하는 조각이 차례로 시도되고, 그 주기가 반복된다.각 결찰 후 자기장이 방출되고 확장된 프라이머의 길이가 측정됩니다.결찰 시 프라이머가 7개의 베이스로 연장되어 머리핀의 끝과 끝 사이의 거리가 눈에 띄게 증가합니다.위치 2의 RNase 절단 후 다음 결찰 사이클을 준비하기 위한 결찰이 이어지며, 따라서 다음 결찰은 이전 [10]결찰 바로 앞에 배치된다.

7nt 프라이머 라이브러리

7-nt 프라이머 라이브러리 5′-NNNNNrX-3,는 짧은 축퇴 올리고뉴클레오티드 프래그먼트인의 결찰에 사용된다.여기서 N은 4개의 디옥시리보뉴클레오티드 중 하나를 나타내고 Nr은 4개의 리보뉴클레오티드 중 하나를 나타내고 X는 시험 염기(A, G, C, T)이다.헤어핀 개폐 사이클에서 테스트된 네 개의 베이스 각각에 대한 프라이머 스트랜드에 대한 결합을 [1]테스트합니다.

결찰

7-nt 프라이머는 헤어핀의 열린 상태에서 결합되어 마지막 7개의 뉴클레오티드의 재지핑을 차단하고 표면과 자기 구슬 사이의 거리를 최대 5nm까지 [1]증가시킵니다.결찰에 실패하면 헤어핀 길이의 변화가 관찰되지 않습니다.

RNase

마지막 6개의 뉴클레오티드의 RNase 분해는 결찰에 이은 다음 단계로, 궁극적으로 프라이머 가닥을 단일 염기만큼 확장시킨다.이러한 균열은 머리핀의 6개의 뉴클레오티드를 재지핑할 수 있으며, 이는 머리핀 길이가 ~4 [1]nm로 감소된 것을 의미한다.따라서 상보적 뉴클레오티드의 혼입은 7개의 뉴클레오티드(+5nm)의 증가에 이어 6개의 뉴클레오티드(-4nm)[1]의 감소로 나타난다.

키나아제

마지막 6개의 뉴클레오티드의 RNase 분해 후, 다음 단계는 키나제를 통한 5' 말단의 인산화이다.그런 다음 다음 결찰 주기를 반복할 수 있습니다.

단분자 염기서열 분석에서 자기방식의 장점

검출된 신호의 특성

경쟁적인 많은 단일 분자 배열 방법은 형광 라벨이 부착된 [4][5]뉴클레오티드의 통합에 의존한다.차세대 시퀀싱에서는 클러스터의 형광신호를 쉽게 검출할 수 있다.단, 단일 분자 시퀀싱에 동일한 개념을 적용할 경우 오류율이 높기 때문에 가장 큰 문제가 발생합니다.라벨이 붙은 단일 분자를 검출하는 것은 어렵기 때문에 이들 플랫폼은 신호 대 잡음비가 낮아 자주 오검출 또는 형광신호의 [13]비검출이 발생합니다.자기 시퀀싱의 경우 측정된 신호는 헤어핀의 양 끝 사이의 거리 변화입니다.이러한 신호는 표준 카메라로 쉽게 검출할 수 있습니다.따라서 고가의 이미징 디바이스를 사용하지 않아도 신호를 쉽게 검출할 수 있습니다.

단일핵산 판별을 위한 실험적 제약 완화

검출된 신호의 성질에 가세해, 이 플랫폼의 다른 실장에서는, 한층 더 높은 신호 대 잡음비를 실현할 수 있습니다.하이브리드화에 의한 자기배열처리의 경우 8-mer의 [1]하이브리드화에 의해 각 뉴클레오티드의 배열을 결정하도록 한 쌍의 겹치는 타일을 사용한다.따라서 기기는 6nm(8뉴클레오티드의 길이)의 변화를 감지하기 위한 민감도만 필요로 한다.마찬가지로 결찰 사이클에 의한 배열의 경우 성공적인 혼입은 머리핀 길이가 [1]약 5nm 증가(7-mer의 결찰)한 후 약 4nm 감소(6-mer의 RNase 절단)하는 것이 특징이다.이 경우, 두 번째 단계의 길이 감소는 얻어진 신호에 대한 추가 확인을 제공합니다.

기술적 고려 사항

결의안

현재 방법에서는 측정된 머리핀 길이의 계측 오차는 1-1.[1]5nm입니다.염기쌍 또는 2개의 확장된 단일 가닥 뉴클레오티드의 길이는 약 0.85 [1]nm이다.그러므로, 시스템의 분해능은 몇 개의 뉴클레오티드에 있다.소음원은 확장된 머리핀에 의해 고정된 비드의 길이에 의존하는 브라운 운동, 비드의 위치 결정 시 통계적 오류 및 느린 기계적 [1]표류에서 발생합니다.단, 앞에서 설명한 바와 같이 4nm 이상의 변화가 측정되고 있기 때문에 현재 시퀀싱 방법으로는 이러한 분해능이 충분하다.

스루풋

자기 [6]트랩을 사용하면 수백만 개의 DNA 헤어핀으로 연결된 자기 비즈에 병렬로 일정한 자기력을 가할 수 있습니다.트랩과 마그네틱 비즈 사이의 거리를 변경하여 자력을 쉽게 조정할 수 있습니다.이 플랫폼의 판독 스루풋을 결정하는 동시에 감시할 수 있는ead의 수는 비드 크기, 테더링된 DNA 헤어핀 길이 및 광분해능 [1]제한에 의해 제한됩니다.현재 750K/mm2(Illumina HiSeq [14]2000과 동일)의 밀도를 달성할 [1]수 있습니다.

읽기 길이

위와 같이, 비드의 브라운 변동에 의한 노이즈는 길이에 따라 증가합니다.이 시스템의 최대 읽기 길이를 결정하기 위한 강력한 시퀀스 테스트는 아직 수행되지 않았습니다.그러나 1241 뉴클레오티드 길이의 헤어핀 가운데 7-mer의 결찰이 성공적으로 검출되었으며, 이는 현재 시스템이 [1]최대 500bp까지 배열하기에 충분함을 시사한다.

기타 제한 사항

시퀀싱 또는 이미징 속도는 자기 비드의 기계적 이동 속도에 따라 달라지며, 이는 드래그 힘에 [1]의해 제한됩니다.현재 초당 [1]10개의 헤어핀 개폐 주기를 측정할 수 있습니다.추가적인 합병증은 관심 DNA에 2차 헤어핀 구조의 존재를 포함한다.이 경우 결합되는 DNA 루프는 [1]대상 DNA의 내인성 루프의 폐쇄보다 폐쇄가 유리하도록 설계되어야 한다.

레퍼런스

  1. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w Ding F, Manosas M, Spiering MM, Benkovic SJ, Bensimon D, Allemand JF, Croquette V (March 2012). "Single-molecule mechanical identification and sequencing". Nat. Methods. 9 (4): 367–72. doi:10.1038/nmeth.1925. PMC 3528176. PMID 22406857.
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