서열 포화 돌연변이 유발

Sequence saturation mutagenesis

시퀀스 포화 돌연변이 유발물질(SeSaM)은 단백질과 효소의 방향 진화에 적용된 화학적합성 무작위 돌연변이 유발 물질이다.[citation needed]그것은 가장 흔한 포화 돌연변이 유발 기술 중 하나이다.PCR 기반의 네 가지 반응 단계에서, 인광로티오테이트 뉴클레오티드는 유전자 서열 속에 삽입되어, 분해되고, 그 결과로 생긴 파편들이 보편적이거나 퇴화된 뉴클레오티드에 의해 길쭉하게 된다.그런 다음 이러한 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드로 대체되어 전이 선호와 연속적인 점 돌연변이에 독특한 초점을 두고 유전자 염기서열 전체에 걸쳐 확산되는 핵산 돌연변이의 광범위한 분포를 허용하며, 두 가지 모두 다른 돌연변이 기법에 의해 발생하기 어렵다.이 기술은 울리히 슈와네베르크 제이콥스 대학교 브레멘과 RWTH 아헨 대학교 교수에 의해 개발되었다.

기술, 개발 및 장점

SeSaM은 단순한 오류 발생성 PCR(EpPCR) 기법을 기반으로 표준 돌연변이 유발물질(Mutagenesis) 방식으로 작업할 때 발생하는 몇 가지 주요 한계를 극복하기 위해 개발됐다.이러한 epPCR 기법은 중합체의 사용에 의존하므로, 핵산 대체는 주로 단일하지만 매우 드물게 연속적인 핵산 대체만 수행되고 이러한 대체는 일반적으로 특정 선호 위치에서만 수행되는 상황에서 야기되는 한계에 직면한다.게다가 핵산의 전이들은 전환보다 훨씬 덜 가능성이 있고, 변화된 편견을 가진 특별히 설계된 중합체를 필요로 한다.[1]이러한 epPCR 촉매 핵산 교환의 특성은 유전 코드가 퇴보된다는 사실과 함께 아미노산 수준의 다양성을 감소시킨다.동의어 대체물이 아미노산 보존으로 이어지거나 크기나 수생성 등 물리화학적 특성이 유사한 보수적 돌연변이가 강하게 만연하고 있다.[2][3]유전자 배열의 모든 위치에서 범용 염기의 비특이적 도입에 의해, SeSaM은 특정 위치에서 일시적 대체에 유리한 중합효소 편향성을 극복하지만, 완전한 유전자 염기서열을 다양한 배열의 아미노산 교환에 개방한다.[4]

표준 epPCR 방법(전환 바이어스가 있는 단일 뉴클레오티드 대체)과 시퀀스 포화 돌연변이 유발 방법(트랜스비율을 높인 연속 뉴클레오티드 대체법 도입)을 사용하여 얻을 수 있는 아미노산 대체 패턴 비교.

SeSaM-method 개발 중에 여러 개의 돌연변이를 동시에 도입할 수 있도록 하는 여러 가지 수정 사항이 도입되었다.[5]보편적인 이노신 대신 퇴화된 염기성의 도입과 최적화된 DNA 중합체의 사용으로 도입되는 전이 비율을 더욱 증가시킴으로써 이 방법의 또 다른 발전이 이루어졌다.[6]이와 함께 수정된 SaaSM-TV+ 방식은 두 개의 연속적인 뉴클레오티드 교환의 도입을 허용하고 선호하기 때문에 대체될 수 있는 아미노산의 스펙트럼이 강하게 넓어진다.

포함한 몇몇 최적화까지 스텝 III가 SeSaM-TV-II 법[7][8]의 향상된 키메라 중합 효소와 티민아와 시토신 염기의 효율적인 대체와 SeSaM-P[9]생성된 도서관의 증가된 돌연변이 빈도를 위한 대안으로 지탄의 추가의 응용 프로그램에서도 점 정확과 개선됐다o transversion 번호와 연속된 돌연변이의 수는 최대 [10]30%의 연속 돌연변이의 비율로 2–4 연속 돌연변이로 증가되었다.

절차

SeSaM-ethod는 2-3일 이내에 실행될 수 있는 4개의 PCR 기반 단계로 구성된다.주요 부분은 인광 뉴클레오티드의 통합, 이러한 위치에서의 화학적 단편화, 보편적 또는 퇴보적 베이스의 도입, 자연 뉴클레오티드의 점 돌연변이 삽입에 의한 대체 등이다.

시퀀스 포화 돌연변이 유발 방법을 사용하여 편향되지 않은 무작위 돌연변이 유발 라이브러리를 생성하기 위한 실험 단계.

초기에는 PCR에 의해 관심 유전자 앞과 뒤에 유전자 고유의 프라이머가 결합되어 보편적인 "SeSaM"-시퀀스를 삽입한다.그 옆구리 영역과의 관심 유전자는 이러한 SeSaM_fwd 및 SeSaM_rev 시퀀스를 도입하고 연속적인 PCR 스텝에 대한 템플릿을 생성하기 위해 증폭된다.

이렇게 생성된 소위 fwd 템플릿과 rev 템플릿은 이제 유전자 전체 길이에 걸쳐 삽입된 돌연변이의 균등한 분포를 보장하기 위해 인광로티오테이트와 표준 뉴클레오티드의 사전 정의된 혼합으로 PCR 반응으로 증폭된다.1단계의 PCR 제품은 특별히 인광로티오사이트 결합에서 분해되어 범용 프라이머에서 시작하여 서로 다른 길이의 단일 가닥 DNA 조각 풀을 생성한다.

SaaSM의 2단계에서는 단자 디옥시뉴클레오티딜효소(TdT)에 의해 촉매로 작용하는 (SeSaM 적용의 변경에 따라) DNA 단일 가닥이 1 ~ 몇 개의 보편적 또는 퇴화적 베이스에 의해 연장된다.이 단계는 코돈 전체를 무작위로 변이시키는 특징적인 연속 변이를 도입하기 위한 핵심 단계다.

이후 3단계에서는 PCR이 단일 좌초된 DNA 조각을 해당 전체 길이 역방향 템플릿과 재결합하여 순서에 따라 범용 또는 퇴행된 염기서열을 포함한 전체 길이 이중 좌초 유전자를 생성한다.

유전자의 염기서열에서 범용/탈생성 염기들을 SaM Step 4에서 무작위 표준 뉴클레오티드로 대체함으로써, 대체 돌연변이를 가진 다양한 종류의 전장 유전자 염기서열이 생성되는데, 여기에는 높은 부하의 전이 및 후속 대체 돌연변이가 포함된다.

적용들

SeSaM은 아미노산 수준의 단백질을 직접 최적화하는 데 사용되지만, 이상적인 아미노산 교환을 위해 포화성 돌연변이체에서 테스트할 아미노산 위치를 사전 식별하는 데도 사용된다.SeSaM 성공적으로 효소의 각기 다른 계급의 수많은 지시했다 진화 캠페인에서 보면 이온성 액체 resistance,[11]단백질 분해 효소 증가한 내열성[14]과 분석 application,[13]피타 아제가 높아지세제 tolerance,[12]포도당 산화 효소와 cellulase 같은 선택한 속성을 향해 그들의 개선 적용돼 왔다.그리고 monooxygen대체 전자 기증자를 사용하여 촉매 효율을 개선한 아세.[15]SeSaM은 13개국 이상에서 US770374 B2에 의해 보호되는 특허로, SeSaM-Biotech GmbH의 플랫폼 기술 중 하나이다.

참조

  1. ^ Wong, T.S.; Zhurina, D.; Schwaneberg, U. (2006). "The diversity challenge in directed protein evolution". Comb. Chem. High Throughput Screen. 9 (4): 271–288. doi:10.2174/138620706776843192. PMID 16724918.
  2. ^ Füllen, G.; Youvan D.C. (1994). "Genetic algorithms and recursive ensemble mutagenesis in protein engineering". Complex Int. 1.
  3. ^ Wong, T.S.; Roccatano, D.; Zacharias, M.; Schwaneberg, U. (2006). "A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution". J. Mol. Biol. 355 (4): 858–871. doi:10.1016/j.jmb.2005.10.082. PMID 16325201.
  4. ^ Wong, T.S.; Tee, K.L.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2004). "Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM): a novel method for directed protein evolution". Nucleic Acids Res. 32 (3): e26. doi:10.1093/nar/gnh028. PMC 373423. PMID 14872057.
  5. ^ Wong, T.S.; Tee, K.L.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2005). "Sequence saturation mutagenesis with tunable mutation frequencies". Anal. Biochem. 341 (1): 187–189. doi:10.1016/j.ab.2005.03.023. PMID 15866543.
  6. ^ Wong, T.S.; Roccatano, D.; Loakes, D.; Tee, K.L.; Schenk, A.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2008). "Transversion-enriched sequence saturation mutagenesis (SeSaM-Tv+): A random mutagenesis method with consecutive nucleotide exchanges that complements the bias of error-prone PCR". Biotechnol. J. 3 (1): 74–82. doi:10.1002/biot.200700193. PMID 18022859. S2CID 9111046.
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