쌍끝 태그

Paired-end tag

페어링 엔드 태그(PET)("Disper-End diTags" 또는 단순히 "Ditags")는 DNA 조각의 5'와 3'끝에 있는 짧은 시퀀스로서, 게놈에서 한 번만 함께 존재할 수 있을 만큼 충분히 독특하며, 따라서 그 사이에 있는 DNA의 시퀀스를 검색할 때 사용할 수 있게 한다(전체 유전자 시퀀스를 사용할 수 있는 경우). o추가 시퀀싱 시 r(태그 사이트는 프라이머 아닐링 사이트로 사용할 수 있을 만큼 고유하기 때문에).PET(페어엔드 태그)는 PET 라이브러리에 존재하며 DNA가 개입되지 않으며 즉, PET는 짧은 5' 링커 시퀀스, 짧은 5' 시퀀스 태그, 짧은 3' 시퀀스 태그 및 짧은 3'링커 시퀀스로 구성하여 게놈 또는 cDNA의 더 큰 파편을 "재현"한다.13개의 기본 쌍이 태그를 고유하게 매핑하기에 충분하다는 것을 개념적으로 보여주었다.[1]그러나 읽기 맵핑에는 고유하게 긴 시퀀스가 더 실용적이다.PET를 생산하는 데 사용되는 엔도뉴클레아제(아래 설명)는 더 긴 태그(18/20 베이스 쌍과 25/27 베이스 쌍)를 제공하지만 50–100 베이스 쌍의 시퀀스는 매핑과 비용 효율성 모두에 최적일 것이다.[1]많은 DNA 조각에서 PET를 추출한 후, 효율적인 염기서열을 위해 서로 연결(결합)한다.평균적으로 20-30개의 태그는 읽기 길이가 더 긴 Sanger 방식으로 시퀀싱될 수 있다.[1]태그 시퀀스가 짧기 때문에 개별 PET는 읽기 길이가 짧고 처리량이 높은 차세대 시퀀싱에 적합하다.PET 염기서열의 주요 장점은 단편만 염기서열 분석, 게놈의 구조변형 검출, DNA 파편의 한쪽 끝만 관여하는 단일 태그에 비해 게놈에 다시 정렬할 때의 특수성 증가 등이다.

PET 라이브러리 구성

복제 및 복제 없는 PET 라이브러리 구성 워크플로우

PET 라이브러리는 일반적으로 복제 기반과 무복제 기반이라는 두 가지 일반적인 방법으로 준비된다.

복제 기반

파편화된 유전체 DNA 또는 관심 보완 DNA(cDNA)는 플라스미드 벡터로 복제된다.복제 사이트에는 내핵물질에 대한 제한 사이트가 포함된 어댑터 시퀀스가 측면에 있다(아래 설명 참조).삽입물은 플라스미드 벡터에 연결되고 개별 벡터는 대장균으로 변형되어 PET 라이브러리를 만든다.PET 시퀀스는 플라스미드를 정화하고 특정 엔도누클리스로 소화를 하여 벡터 끝에 두 개의 짧은 시퀀스를 남김으로써 얻는다.분자 내(질자) 상태에서는 벡터가 다시 순환되고 묶여서 디태그만 벡터에 남는다.클론 고유의 시퀀스가 이제 서로 짝을 이룬다.차세대 시퀀싱 기법에 따라 PET 시퀀스는 단수, 조광 또는 긴 체인으로 결합할 수 있다.[1]

무복제 기반

복제 대신, 엔도누클레스 시퀀스를 포함하는 어댑터는 조각난 유전체 DNA나 cDNA의 끝에 묶인다.그런 다음 분자들은 자가 순환되고 내분자(endonuclease)로 소화되어 PET를 방출한다.[1]시퀀싱 전에 이러한 PET는 증폭을 위해 PCR 프라이머가 어닐링되는 어댑터에 연결된다.도서관 건립 기반 복제의 장점은 향후 사용을 위해 조각이나 cDNA를 온전하게 유지한다는 점이다.그러나 복제 없는 방식보다 건설 과정이 훨씬 길다.도서관 건립에 관한 변형은 차세대 염기서열 회사들이 각자의 기술에 맞게 제작해 왔다.[1]

엔도뉴클레아제

다른 엔도뉴클레아제와는 달리, MmeI(유형 IIS)와 EcoP15I(유형 III) 제한 엔도뉴클레아제는 표적 결합 사이트의 다운스트림을 차단한다.MMEI는 18/20 베이스 쌍을 다운스트림에서, EcoP15I는 25/27 베이스 쌍을 다운스트림에서 절단한다.[3]이러한 제한 효소는 어댑터에 위치한 목표 시퀀스에 결합되기 때문에, 단편 또는 cDNA의 짧은 시퀀스가 포함된 벡터를 잘라내고 방출하여 PET를 생성한다.

PET 응용 프로그램

삭제 및 삽입에 대한 PET 탐지 예제.
RNA-PET에 의해 검출된 대체 대본 구조물의 예.
  1. DNA-PET: PET는 태그 간의 연결을 나타내기 때문에 게놈 재시퀀싱에서 PET를 사용하는 것은 단일 판독치 사용보다 장점이 있다.이 응용 프로그램을 쌍방향 끝 시퀀싱이라고 하는데, 구어적으로 이중 막대형 엽총 시퀀싱으로 알려져 있다.쌍의 반을 게놈의 단일 위치에 고유하게 고정시키면 모호한 나머지 반쪽을 매핑할 수 있다.애매모호한 읽기는 한 곳 이상에 매핑되는 읽기다.이렇게 효율성이 높아지면 이러한 모호한 순서, 즉 읽기는 일반적으로 폐기되기 때문에 시퀀싱 비용이 감소한다.또한 PET 시퀀스를 연결하면 삽입, 삭제, 중복, 반전, 번역 등의 구조적 변화를 탐지할 수 있다.[1][4]PET 라이브러리를 건설하는 동안, 조각들은 모두 일정한 크기로 선택할 수 있다.따라서 매핑 후, PET 시퀀스는 서로로부터 일정한 거리만큼 떨어져 있을 것으로 예상된다.이 거리로부터의 불일치는 PET 시퀀스 사이의 구조적 변화를 나타낸다.예를 들어(오른쪽 그림): 염기서열화된 게놈의 삭제는 참조 게놈에서 예상보다 멀리 떨어진 곳에서 그 지도를 읽게 될 것이다. 참조 게놈은 염기서열화된 게놈에 존재하지 않는 DNA의 한 부분을 갖게 될 것이기 때문이다.
  2. ChIP-PET: Chipatin 면역소모화(ChIP)와 PET를 결합하여 관심 단백질로 묶인 DNA 부위를 검출하는 데 사용된다.Chip-PET는 단일 읽기 시퀀싱보다 생성되는 읽기의 모호성을 줄임으로써 이점이 있다.칩 하이브리드화(Chip-Chip)에 비해 이점은 하이브리드화 타일링 어레이가 시퀀스 판독이 갖는 통계적 민감도를 갖지 못한다는 것이다.하지만, Chip-PET, Chip-Seq[5][6][7], Chip-chip은[8] 모두 매우 성공적이었다.[1]
  3. ChIA-PET:염색질 상호작용 분석에 대한 PET 시퀀싱 적용.단백질 인자에 묶인 DNA 원소들 간의 데노보 장거리 상호작용을 찾아내기 위한 게놈전위 전략이다.[9]최초의 ChIA-PET는 풀우드 외 연구진에 의해 개발되었다.(2009년)[9] 에스트로겐 처리된 인간의 가슴 아데노카르신종 세포에서 에스트로겐 수용체 α(ER-α)[9]로 묶인 염색질 사이의 상호작용 지도를 생성한다.ChIA-PET는 알려지지 않은 DNA 원소들 간의 상호작용을 탐지할 수 있기 때문에 상호작용을 분석하는 편견이 없는 방법이다.이와는 대조적으로 3C와 4C 방법은 게놈의 특정 표적 영역과 관련된 상호작용을 검출하는 데 사용된다.ChIA-PET는 쌍체 태그가 게놈의 다른 영역에 매핑된다는 점에서 RNA-PET를 통해 융합 유전자를 찾는 것과 비슷하다.[1]단, ChIA-PET는 RNA-PET에서와 같이 두 유전체 영역 사이에 자연적으로 융합을 일으키기보다는 서로 다른 유전체 영역에 위치한 서로 다른 DNA 조각들 사이의 인공 결합을 포함한다.
  4. RNA-PET:이 애플리케이션은 성적 증명서, 유전자 구조, 유전자 표현 등 성적 증명서 연구에 사용된다.[1][10]PET 라이브러리는 전체 길이 cDNA를 사용하여 생성되므로, 디태그는 개별 대본의 5' 상한 및 3' 폴리A 꼬리 서명을 나타낸다.따라서 RNA-PET는 특히 전사 단위의 경계를 구분하는데 유용하다.이것은 대체 전사 시작 부위와 유전자의 다아데닐화 부지를 식별하는 데 도움이 될 것이다.[1]RNA-PET는 또한 핵융합 유전자와 트랜스 스플링 검출에도 사용될 수 있지만, 그것들 사이를 구별하기 위해서는 더 많은 실험이 필요하다.[11]대본의 경계를 찾는 다른 방법으로는 단일 태그 전략 CAGE, SAGE 및 가장 최근의 SUPERSAGE가 있으며, CAGE와 5' SAGE는 전사 시작 사이트를 정의하고, 3' SAGE는 다면체화 사이트를 정의한다.[1]이러한 방법에 비해 PET 시퀀싱의 장점은 PET가 대본의 양쪽 끝을 식별하는 동시에 게놈에 다시 매핑할 때 보다 구체적인 내용을 제공한다는 것이다.cDNA의 염기서열 분석은 대본의 구조를 매우 상세하게 밝힐 수 있지만, 이 접근법은 RNA-PET 염기서열 분석보다 훨씬 비용이 많이 들며, 특히 전체 대본의 특성을 분석하는 데에도 그러하다.[10]RNA-PET의 주요 한계는 대화록의 내부 exon의 구성에 관한 정보의 부족이다.따라서 RNA-PET는 대체 스플라이싱 검출에는 적합하지 않다.또한, 복제 절차를 사용할 경우 PET를 생성하기 전에 cDNA 라이브러리를 구성할 경우 (긴 대본의 결과로) 복제하기 어려운 cDNA의 적용 범위가 낮아진다.[10]마찬가지로 표현 수준이 낮은 대본(또는 대본 이소양식)도 잘 표현되지 않을 수 있다.

참조

  1. ^ a b c d e f g h i j k l 풀우드 MJ, 웨이 CL, 류 ET, 루안 Y. 2009.transcriptome 및 게놈 분석을 위한 PET(페어엔드 태그)의 차세대 DNA 시퀀싱.게놈 연구. 19:521–532. PMID19339662
  2. ^ 모건 RD, 바티아 TK, 로바스코 L, 데이비스 TB 2008MmeI: 호스트 보호를 위해 하나의 DNA 가닥만 수정하는 최소 타입 II 제한 수정 시스템.핵산 자원 36:6558–6570.
  3. ^ 마츠무라 H, 라이히 S, 이토 A, 사이토 H, 카문 S, 윈터 P, 칼 G, 로이터 M, 크루거 DH, 테라우치 R. 2003.SuperSage에 의한 식물 호스트-병원체 상호작용의 유전자 발현 분석.프로크. 나틀아카드. 공상과학 100:15718–15723.
  4. ^ 맥커넌 외2009. 2-base 인코딩을 사용한 짧은 판독, 대량 병렬 레인지 시퀀싱에 의해 밝혀진 인간 게놈의 시퀀스 및 구조 변화.게놈 연구. 19:1527-1541.
  5. ^ 바르스키 A, 쿠이다파 S, 쿠이 K, 노 TY, 쇼네스 DE, 왕 Z, 웨이 G, 체펠레프 I, 자오 K. 2007.인간 게놈의 히스톤 메틸화에 대한 고해상도 프로파일링.129:823–837.
  6. ^ 존슨 DS, 모타자비 A, 마이어스 RM, 월드 B. 2007.체내 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전체 매핑.과학316:1497–1502.
  7. ^ Chen X 외 2008.외부 신호 경로와 배아 줄기세포의 핵심 전사 네트워크의 통합.133호: 1106–1117호.
  8. ^ Wu J, Smith LT, Plass C, Huang TH. 2006.ChIP 칩은 게놈 전반에 걸친 기능분석을 위한 성년이 되었다.암 66(14): 6899–902
  9. ^ a b c 풀우드 MJ, 류 MH, 팬 YF 등.2009. 에스트로겐-수용체-알파 결합 인간 염색질 상호작용.자연462: 58-64.
  10. ^ a b c Ng P, Wei CL, Sung WK 등 2005.유전자 식별 시그니처(GIS) 분석으로 대본특성화 및 게놈 주석화.Nat. 방법.2: 105–111.
  11. ^ Ruan Y, Ooi HS, Choo SW et al. 2007.PET(Pairled-End diTags)를 사용한 종합적인 성적표 분석을 통해 발견된 융접 대본 및 역변환 로키.게놈 연구서 17: 828–838.