시클로헥시미드 추적

Cycloheximide chase

시클로헥시미드 추적 분석은 분자 및 세포 생물학에서 정상 상태의 단백질 안정성을 측정하기 위해 사용되는 실험 기술입니다.시클로헥시미드는 진핵생물 단백질 번역의 신장 단계를 억제하여 단백질 [1]합성을 방해하는 약물이다.배양 세포에 시클로헥시미드를 첨가한 후 여러 시점에서 단백질 용해를 하는 것은 시간 경과에 따른 단백질 저하를 관찰하기 위해 수행되며 단백질의 반감기를 결정하는 데 사용될 수 있다.단백질의 풍부성을 평가하기 위해 웨스턴 블롯이 뒤따르는 경우가 많으며 ImageJ와 [2]같은 정량적 도구를 사용하여 분석할 수 있습니다.

실행

시클로헥시미드 추적 분석은 효모와 포유류 세포주와 [3][4][5][6]같은 다양한 세포 유형을 사용하여 수행되었습니다.분석에 사용되는 세포 시스템에 따라 적용 및 시간 과정이 달라질 수 있습니다.예를 들어, 관심 있는 단백질 기질을 발현하는 효모 세포는 일반적으로 단백질 교체가 [7][8]일어나도록 하기 위해 최대 90분 동안 시클로헥시미드 체이스를 필요로 한다.반대로 포유동물 세포주에 발현되는 단백질은 안정된 상태에서 나에게 더 안정적이고 3~8시간 [9][10][11]동안 추적해야 할 수 있다.단백질의 복잡성과 모델 시스템에 과도하게 발현되거나 내인성 여부에 따라 필요한 추적 길이가 달라질 수 있습니다.전체 추적 중에 단백질 합성이 억제되도록 보장하기 위해, 시클로헥시미드는 종종 두 시간마다 샘플에 주입됩니다.

효모에서 결실주는 시클로헥시미드 체이스에 의한 시간 경과에 따른 단백질 안정성을 평가하기 위해 자주 사용된다.예를 들어 [12][13]샤페론, E3 연결효소 및 액포 단백질과 같은 중요한 분해기계가 결여된 효모균주는 관심 단백질 기질에 대한 분해기구를 결정하기 위해 자주 사용된다.약물 치료법(MG132)은 또한 분해 단계를 억제하기 위해 사용되며, 이어서 관심 단백질의 안정성에 어떤 영향을 [14][15][16]미치는지 관찰하기 위해 시클로헥시미드 추적이 뒤따른다.이러한 실험은 포유동물 세포에서 효모 결실주 [17]대신 호환되는 녹다운 절차를 구현하여 수행할 수 있다.

시클로헥시미드 체이스는 또한 다른 돌연변이가 단백질의 안정성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 중요하다.단백질 안정성에 필요한 중요한 잔류물과 질병과 관련된 돌연변이가 [18][19]세포 내의 단백질 반감기에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해 효모와 포유동물 세포에서 실험이 수행되었다.이 정보는 단백질 접힘의 복잡성과 돌연변이가 관련된 질병의 병인에 어떻게 기여하는지를 이해하는 데 중요합니다.

이점

단백질 안정성을 평가하는 다른 방법들과 달리 시클로헥시미드 추적 분석을 사용하는 것에는 많은 이점이 있다.시클로헥시미드 체이스는 다양한 모델 시스템과 함께 사용할 수 있으며 거의 모든 단백질 기질을 연구하기 위해 구현될 수 있다.시클로헥시미드는 다른 약물에 비해 상대적으로 저렴한 화합물이며 저용량으로 단기간 사용할 때 효과적이다.맥박 추적 검사는 시클로헥시미드 추적 분석의 대체 방법이며, 유사한 "추적"[20] 기간이 이어지는 새롭게 번역된 단백질의 방사능 라벨 부착을 포함합니다.이 방법은 유익하고 초기 단백질의 풍부함을 관찰할 수 있는 이점을 제공하지만, 필요한 방사성 물질은 가격이 비싸고 유통기한이 짧으며 시클로헥시미드보다 사용에 더 주의를 요한다.

단점들

시클로헥시미드 추적 검사를 수행하는 것의 몇 가지 단점은 시클로헥시미드의 독성 성질을 포함한다.오랜 시간 동안 고농도로 사용될 때, 시클로헥시미드는 세포 내의 DNA를 손상시키고 중요한 세포 [21]기능을 손상시킵니다.따라서 시클로헥시미드 체이스는 일반적으로 12시간 이상 지속되지 않습니다.이것은 특히 안정적인 단백질의 교체가 연구되고 있는 경우 한계를 나타낸다.또한, 시클로헥시미드 체이스는 맥박 체이스와 같이 새롭게 번역된 단백질 수치와 대조적으로 정상 상태의 단백질 수치를 볼 수 있는 능력만 제공합니다.따라서 단백질의 성숙이 아닌 단백질 분해만 관찰할 수 있다.

레퍼런스

  1. ^ Schneider-Poetsch, Tilman; Ju, Jianhua; Eyler, Daniel E.; Dang, Yongjun; Bhat, Shridhar; Merrick, William C.; Green, Rachel; Shen, Ben; Liu, Jun O. (2010). "Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin". Nature Chemical Biology. 6 (3): 209–217. doi:10.1038/nchembio.304. PMC 2831214. PMID 20118940.
  2. ^ Girish, V.; Vijayalakshmi, A. (2004). "Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ". Indian Journal of Cancer. 41 (1): 47. PMID 15105580.
  3. ^ Preston, G. M.; Guerriero, C. J.; Metzger, M. B.; Michaelis, S.; Brodsky, J. L. (2018). "Substrate Insolubility Dictates Hsp104-Dependent Endoplasmic-Reticulum-Associated Degradation". Molecular Cell. 70 (2): 242–253.e6. doi:10.1016/j.molcel.2018.03.016. PMC 5912696. PMID 29677492.
  4. ^ Kim Chiaw, P.; Hantouche, C.; Wong MJH; Matthes, E.; Robert, R.; Hanrahan, J. W.; Shrier, A.; Young, J. C. (2019). "Hsp70 and DNAJA2 limit CFTR levels through degradation". PLOS ONE. 14 (8): e0220984. Bibcode:2019PLoSO..1420984K. doi:10.1371/journal.pone.0220984. PMC 6692068. PMID 31408507.
  5. ^ Needham, P. G.; Goeckeler-Fried, J. L.; Zhang, C.; Sun, Z.; Wetzel, A. R.; Bertrand, C. A.; Brodsky, J. L. (2021). "SLC26A9 is selected for endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) via Hsp70-dependent targeting of the soluble STAS domain". The Biochemical Journal. 478 (24): 4203–4220. doi:10.1042/BCJ20210644. PMC 8826537. PMID 34821356.
  6. ^ Amico, G.; Brandas, C.; Moran, O.; Baroni, D. (2019). "Unravelling the Regions of Mutant F508del-CFTR More Susceptible to the Action of Four Cystic Fibrosis Correctors". International Journal of Molecular Sciences. 20 (21): 5463. doi:10.3390/ijms20215463. PMC 6862496. PMID 31683989.
  7. ^ Kim Chiaw, P.; Hantouche, C.; Wong MJH; Matthes, E.; Robert, R.; Hanrahan, J. W.; Shrier, A.; Young, J. C. (2019). "Hsp70 and DNAJA2 limit CFTR levels through degradation". PLOS ONE. 14 (8): e0220984. Bibcode:2019PLoSO..1420984K. doi:10.1371/journal.pone.0220984. PMC 6692068. PMID 31408507.
  8. ^ Needham, P. G.; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, A. C.; Subramanya, A. R.; Brodsky, J. L. (2011). "The thiazide-sensitive NaCl cotransporter is targeted for chaperone-dependent endoplasmic reticulum-associated degradation". The Journal of Biological Chemistry. 286 (51): 43611–43621. doi:10.1074/jbc.M111.288928. PMC 3243568. PMID 22027832.
  9. ^ Kim Chiaw, P.; Hantouche, C.; Wong MJH; Matthes, E.; Robert, R.; Hanrahan, J. W.; Shrier, A.; Young, J. C. (2019). "Hsp70 and DNAJA2 limit CFTR levels through degradation". PLOS ONE. 14 (8): e0220984. Bibcode:2019PLoSO..1420984K. doi:10.1371/journal.pone.0220984. PMC 6692068. PMID 31408507.
  10. ^ Needham, P. G.; Goeckeler-Fried, J. L.; Zhang, C.; Sun, Z.; Wetzel, A. R.; Bertrand, C. A.; Brodsky, J. L. (2021). "SLC26A9 is selected for endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) via Hsp70-dependent targeting of the soluble STAS domain". The Biochemical Journal. 478 (24): 4203–4220. doi:10.1042/BCJ20210644. PMC 8826537. PMID 34821356.
  11. ^ Amico, G.; Brandas, C.; Moran, O.; Baroni, D. (2019). "Unravelling the Regions of Mutant F508del-CFTR More Susceptible to the Action of Four Cystic Fibrosis Correctors". International Journal of Molecular Sciences. 20 (21): 5463. doi:10.3390/ijms20215463. PMC 6862496. PMID 31683989.
  12. ^ Needham, P. G.; Goeckeler-Fried, J. L.; Zhang, C.; Sun, Z.; Wetzel, A. R.; Bertrand, C. A.; Brodsky, J. L. (2021). "SLC26A9 is selected for endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) via Hsp70-dependent targeting of the soluble STAS domain". The Biochemical Journal. 478 (24): 4203–4220. doi:10.1042/BCJ20210644. PMC 8826537. PMID 34821356.
  13. ^ Needham, P. G.; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, A. C.; Subramanya, A. R.; Brodsky, J. L. (2011). "The thiazide-sensitive NaCl cotransporter is targeted for chaperone-dependent endoplasmic reticulum-associated degradation". The Journal of Biological Chemistry. 286 (51): 43611–43621. doi:10.1074/jbc.M111.288928. PMC 3243568. PMID 22027832.
  14. ^ Preston, G. M.; Guerriero, C. J.; Metzger, M. B.; Michaelis, S.; Brodsky, J. L. (2018). "Substrate Insolubility Dictates Hsp104-Dependent Endoplasmic-Reticulum-Associated Degradation". Molecular Cell. 70 (2): 242–253.e6. doi:10.1016/j.molcel.2018.03.016. PMC 5912696. PMID 29677492.
  15. ^ Kim Chiaw, P.; Hantouche, C.; Wong MJH; Matthes, E.; Robert, R.; Hanrahan, J. W.; Shrier, A.; Young, J. C. (2019). "Hsp70 and DNAJA2 limit CFTR levels through degradation". PLOS ONE. 14 (8): e0220984. Bibcode:2019PLoSO..1420984K. doi:10.1371/journal.pone.0220984. PMC 6692068. PMID 31408507.
  16. ^ Needham, P. G.; Mikoluk, K.; Dhakarwal, P.; Khadem, S.; Snyder, A. C.; Subramanya, A. R.; Brodsky, J. L. (2011). "The thiazide-sensitive NaCl cotransporter is targeted for chaperone-dependent endoplasmic reticulum-associated degradation". The Journal of Biological Chemistry. 286 (51): 43611–43621. doi:10.1074/jbc.M111.288928. PMC 3243568. PMID 22027832.
  17. ^ Kim Chiaw, P.; Hantouche, C.; Wong MJH; Matthes, E.; Robert, R.; Hanrahan, J. W.; Shrier, A.; Young, J. C. (2019). "Hsp70 and DNAJA2 limit CFTR levels through degradation". PLOS ONE. 14 (8): e0220984. Bibcode:2019PLoSO..1420984K. doi:10.1371/journal.pone.0220984. PMC 6692068. PMID 31408507.
  18. ^ Preston, G. M.; Guerriero, C. J.; Metzger, M. B.; Michaelis, S.; Brodsky, J. L. (2018). "Substrate Insolubility Dictates Hsp104-Dependent Endoplasmic-Reticulum-Associated Degradation". Molecular Cell. 70 (2): 242–253.e6. doi:10.1016/j.molcel.2018.03.016. PMC 5912696. PMID 29677492.
  19. ^ Amico, G.; Brandas, C.; Moran, O.; Baroni, D. (2019). "Unravelling the Regions of Mutant F508del-CFTR More Susceptible to the Action of Four Cystic Fibrosis Correctors". International Journal of Molecular Sciences. 20 (21): 5463. doi:10.3390/ijms20215463. PMC 6862496. PMID 31683989.
  20. ^ Sun, Z.; Guerriero, C. J.; Brodsky, J. L. (2021). "Substrate ubiquitination retains misfolded membrane proteins in the endoplasmic reticulum for degradation". Cell Reports. 36 (12): 109717. doi:10.1016/j.celrep.2021.109717. PMC 8503845. PMID 34551305.
  21. ^ Bašić-Zaninović, Tamara; Papeš, Dražena; Franekić, Jasna (1991). "Cycloheximide genotoxicity in in vitro and in vivo test systems". Mutation Research Letters. 263 (4): 203–210. doi:10.1016/0165-7992(91)90002-L. PMID 1861684.