싱글 분자 FLET

Single-molecule FRET

단일 분자 형광(또는 Förster) 공명 에너지 전달(또는 smFRET)은 단일 분자(일반적으로 생체 분자)에서 1~10나노미터 척도로 거리를 측정하는 데 사용되는 생물물리학 기술이다.공여체와 수용체 형광체 쌍이 단일 분자 수준에서 들뜨고 검출되는 FLET의 응용입니다.다수의 분자의 FLET 신호를 제공하는 '앙상블 FLET'와는 달리, 단분자 FLET는 각 분자의 FLET 신호를 분해할 수 있다.smFRET 신호의 변동은 특히 시스템이 평형 상태에 있을 때 앙상블 측정이 제공할 수 없는 운동 정보를 밝히는 데 유용합니다.서로 다른 분자 간의 이질성도 관찰될 수 있다.

방법론

전형적인 smFRET 실험(A), FLET 거리 곡선(B) 및 시간 궤적(C)의 스킴.

단일 분자 FLET 측정은 일반적으로 표면 미화 또는 자유 확산 분자를 사용하여 형광 현미경으로 수행됩니다.단일 FLET 쌍은 단일 분자 검출에 충분한 형광 신호를 생성하기 위해 강렬한 광원(일반적으로 레이저)을 사용하여 조명됩니다.광시야 다광자 현미경은 일반적으로 TIRF(Total Internal Reflection 형광 현미경)와 결합됩니다.그러면 측정 챔버 표면의 FRET 쌍이 선택적으로 들뜨고 샘플의 부피에서 발생하는 노이즈가 제거됩니다.또는 공초점 현미경 검사는 형광광을 핀홀에 집중시켜 포커스 빛을 [1]배제함으로써 배경을 최소화한다.공초점 볼륨은 직경이 약 220 nm이므로 샘플의 이미지가 필요한 경우 스캔해야 합니다.공초점 들뜸을 사용하면 TIRF를 사용할 때보다 훨씬 더 깊은 시료를 측정할 수 있습니다.형광신호는 광시야 현미경 [2]검사용 초민감 CCD 또는 과학적 CMOS 카메라 또는 공초점 현미경 검사용 SPAD를 사용하여 검출된다.시간 대비 단일 분자 강도를 이용할 수 있게 되면 FLET 효율은 시간의 함수로서 각 FLET 쌍에 대해 계산될 수 있으며, 따라서 단일 분자 척도의 운동 이벤트를 추적하여 각 분자의 상태 분포를 보여주는 FLET 히스토그램을 구축할 수 있다.그러나 샘플 또는 동적 [4]구조에 대한 일반적인 정보를 얻기 위해서는 많은 FRET 쌍의 데이터를 기록하고 결합해야 한다.

표면 미화

표면 미화 실험에서는 형광 태그가 부착된 생체 분자가 커버글라스 표면에 결합되어 형광 이미지가 획득됩니다(일반적으로 CCD 또는 과학적 CMOS [5]카메라에 의해).카메라로 데이터를 수집하면 시료에 대한 동영상이 생성되며, 이 동영상은 시간이 지남에 따라 단분자 강도를 도출하기 위해 처리되어야 한다.SPAD 검출기를 갖춘 공초점 현미경을 사용할 경우 먼저 시료를 주사하여 분자 탐색을 실시한다.그런 다음 공초점은 분자에 위치하여 강도-시간 데이터를 직접 수집하여 샘플 표류량이 무시할 수 있도록 하거나 분자를 추적하기 위해 능동 피드백 루프를 사용합니다.

표면 미화 실험의 장점은 광 표백(일반적으로 1-30초)까지 오랜 시간 동안 많은 분자를 동시에 관찰할 수 있다는 것입니다.이를 통해 느린 시간 척도로 발생하는 전환을 편리하게 학습할 수 있습니다.단점은 분자를 표면에 연결하기 위해 필요한 추가 생화학적 변형과 표면이 잠재적으로 분자 활동에 가할 수 있는 섭동에 의해 나타난다.또, 단일 분자 인텐시의 최대 해상도는, 카메라의 취득 시간(> 1 ms)에 의해서 제한됩니다.

자유 확산

또한 SmFRET은 액체 시료에서 자유롭게 확산되는 분자의 구조를 연구하는 데 사용될 수 있다.자유 확산 smFRET 실험(또는 확산 기반 smFRET)에서 동일한 생체 분자는 작은 들뜸 부피(일반적으로 회절 제한 지점)에 의해 들뜸되면서 용액에서 자유롭게 확산된다.SPAD 검출기를 사용하여 여자 지점을 가로지르는 단일 분자에 의한 광자 버스트를 획득한다.공초점은 일반적으로 지정된 위치에 고정됩니다(스캔이 수행되지 않고 영상이 획득되지 않음).대신 시료에 존재하는 다른 모집단의 분포를 구축하기 위해 들뜸 부피를 가로지르는 개별 분자에 의해 방출되는 형광광자를 기록하고 축적한다.이 배포의 복잡성에 따라 구입 시간은 최대 5분에서 몇 시간까지 다양합니다.

SPAD 검출기를 사용하는 설정의 특징적인 장점은 카메라를 사용할 때와 같이 "프레임 레이트" 또는 고정 통합 시간에 의해 제한되지 않는다는 것이다.실제로 SPAD는 카메라와 달리 광자가 검출될 때마다 펄스를 생성하는 반면 10-50ns 해상도로 각 펄스를 "타이밍"하려면 추가 전자 장치가 필요합니다.공초점 단일 분자 FLET 측정의 높은 시간 분해능을 통해 최대 10μs의 시간 척도로 역학을 잠재적으로 검출할 수 있습니다.그러나 확산 시간(일반적으로 약 1ms)보다 긴 타임스케일에서 "느린" 전환을 감지하는 것은 표면 미화 실험보다 더 어렵고 일반적으로 훨씬 더 오랜 시간이 필요합니다.

통상, 공여체와 수용체 양쪽의 형광 방출은 2개의 독립된 검출기에 의해 검출되며, FLET 신호는 2개의 채널의 강도 비율로부터 계산된다.일부 설정 구성은 각 스펙트럼 채널(공여체 또는 수용체)을 2개의 직교 편파(따라서 4개의 검출기 필요)로 추가로 분할하여 FLET와 형광 이방성을 동시에 측정할 수 있다.다른 구성에서는 동시에 복수의 FRET 쌍을 측정하기 위해 동시에 3개 또는 4개의 스펙트럼 채널을 취득한다.CW 또는 펄스 레이저를 모두 들뜸 소스로 사용할 수 있습니다.펄스 레이저를 사용하는 경우, 적절한 수집 하드웨어는 피코초 분해능을 가진 마지막 레이저 펄스에 대한 광자 도착 시간을 소위 시간 상관 단일 광자 계수(TCPC) 수집으로 측정할 수 있습니다.이 구성에서 각 광자는 매크로 타임(즉, 대략적인 10~50 ns 타임스탬프)과 마이크로 타임(즉, 마지막 레이저 펄스에 관한 지연)으로 특징지어진다.후자를 사용하여 수명 정보를 추출하고 FLET 신호를 얻을 수 있습니다.

표면 고정화 smFRET의 데이터 분석

2-염색 시스템의 일반적인 smFRET 데이터는 두 채널이라고 불리는 기증자 색소와 수용체 색소의 형광 방출 강도의 시간 궤적이다.두 가지 염료의 방출을 얻기 위해 주로 두 가지 방법이 사용된다. (1) 누적 측정에는 PMT, APD, EMCCD, CMOS 카메라 등 각 프레임에 대한 카메라의 고정 노광 시간이 사용된다. (2) PMT 또는 APD 검출기를 사용하여 측정된 단일 광자 도착 시간 시퀀스가 사용된다.원리는 광학 필터 또는 다이크로이크 미러를 사용하여 두 가지 염료의 방출을 분리하고 두 개의 채널로 측정하는 것입니다.예를 들어,[6] 2개의 반쪽의 전하결합소자(CCD) 카메라를 사용한 설정은 문헌에 설명되어 있다.

2-염색 시스템의 경우, 방출 신호는 시간 경과에 따른 염료 간의 FLET 효율을 계산하기 위해 사용됩니다.FLET 효율은 도너와 액셉터 염료의 방출 합계에 걸쳐 액셉터 염료에서 방출되는 광자의 수입니다.보통 기증자 색소만 들뜨지만 기증자와 수용체 색소가 번갈아 [7]들뜨면 더 정확한 정보를 얻을 수 있다.단일 들뜸 스킴에서 공여체 및 수용체 염료의 방출은 2개의 염료에 대해 수집된 광자의 수를 2개의 채널의 광자 채집 효율, 필터 및 광학 효율, 2개의 파장 b의 카메라 효율의 함수 각각으로 나눈 것이다.그리고 이러한 효율은 주어진 기기 설정에 맞게 보정할 수 있습니다.

여기서 PLET는 일정 시간 동안 2염색 시스템의 FLET 효율성입니다. I_ I는 동일한 시간 동안 각각 수용체와 기증자 채널의 광자 수를 측정한 값입니다. {\ _ 및} \ _DISPLAYLE 두 채널의 광자 채집 효율성 와 는 두 염료의 양자 수율이다.따라서I / { I / \는 염료에서 방출되는 광자의 실제 개수를 계산합니다.두 채널의 광자 채집 효율이 비슷하고 실제 FLET 거리에 관심이 없다면 2 { = 1로 설정하고 2개의 양자 수율도 1로 설정할 수 있다.

(A) 1ms 시간 분해능으로 수집된 수용체(빨간색) 및 기증자(파란색) 채널 광자 카운트의 시간 궤적 예. (B) 노이즈를 줄이기 위해 10ms 시간 분해능으로 데이터를 빈화한다.이 인셋은 방정식을 사용하여 계산된 smFRET 시간 궤적을 보여줍니다.큰 포토마운트 부품은 카운트 의존형 가우스 노이즈에 의해 지배되는 큰 노이즈와 포아송 노이즈에 의해 지배되는 작은 포토마운트 영역은 포아송 노이즈가 지배합니다.

누적 방출 smFRET 데이터에 대해 시간 궤적은 주로 (1) 상태 전이, (2) 노이즈, (3) 카메라 블러링(동작 블러의 아날로그), (4) 염료의 포토 링크 및 광 표백 등의 정보를 포함한다.상태 전이 정보는 일반적인 측정에 필요한 정보입니다.그러나 나머지 신호는 데이터 분석을 방해하므로 대처해야 합니다.

소프트웨어 패키지 목록은 KinSoft Challenge [8]웹 사이트에서 확인할 수 있습니다.이러한 소프트웨어의 비교 결과에 관한 리포트는,[9] 여기를 참조해 주세요.

노이즈

염료 방출의 노이즈 신호에는 일반적으로 카메라 판독 노이즈, 샷 노이즈 및 화이트 노이즈 및 실제 샘플 노이즈가 포함되며, 각각 다른 소스로 인해 다른 노이즈 분포를 따릅니다.실제 샘플 노이즈는 FLET 거리 확대, 불균일한 염료 방향 분포, 염료 방출 변화, 빠른 깜박임 및 통합 시간보다 빠른 속도 역학을 초래하는 시스템의 열 장애에서 발생합니다.염료 방출의 느린 변화는 다른 염료를 선택함으로써 실험적으로 피해야 하는 거짓 양성 상태로 간주될 수 있다.다른 소음은 들뜸 경로와 검출 경로, 특히 카메라에서 발생합니다.결국 원시 방출 데이터의 노이즈는 포아송 분포와 가우스 분포의 노이즈의 조합이다.각 채널의 소음(예: 단일 광자 검출기의 경우)은 강도에 의존하는 가우스 소음(카운트가 높을수록 소음이 커진다. 가우스 함수로 나타낼 수 있는 가우스 및 더 큰 진폭의 포아송 소음의 조합)과 포아송 배경 소음(신호-c)의 합으로 단순화할 수 있다.out-independent).후자의 노이즈는 채널이 OFF 또는 저강도 상태(오른쪽 그림)일 때 주로 발생합니다.그런 다음 두 채널의 노이즈가 위에 나열된 비선형 방정식으로 결합되어 FLET 값을 계산합니다.따라서, smFRET 궤적의 노이즈는 매우 복잡합니다.소음은 평균 FLET 값의 위와 아래에서 비대칭이며 A 및 D 채널의 불확실성 변화에 따라 FLET 값의 양끝(0 및 1) 방향으로 크기가 변화합니다.대부분의 노이즈는 데이터(그림 참조)를 빈화함으로써 시간 분해능을 잃는 비용으로 줄일 수 있습니다.노이즈가 없거나 노이즈가 없는 smFRET 시간 궤적을 시뮬레이션하기 위한 MATLAB 코드의 예는 GitHub(postFRET)를 참조하십시오(GitHub 링크).

카메라의 흔들림

postFRET[10] 시뮬레이터를 사용하여 3스테이트 smFRET의 예를 사용하여 카메라의 흐림을 시뮬레이트합니다(2개의 시뮬레이션).신호 대 노이즈 비는 두 시뮬레이션 모두에서 약 20으로 설정됩니다.시간 분해능은 1ms에서 시뮬레이션된 후 시뮬레이션된 실험의 통합 시간인 10ms로 빈화됩니다.시뮬레이션 속도 상수는 왼쪽에 나열되고 궤적의 작은 부분은 가운데에 표시되며(대체 색상은 다른 분자를 나타냄), 모든 분자의 FLET 히스토그램(100)은 오른쪽에 표시됩니다.

카메라의 흔들림 신호는 측정의 이산적 특성에서 발생합니다.하나 또는 둘 다 확률적(랜덤)이기 때문에 방출 신호가 실제 전이 신호와 일치하지 않습니다.두 개의 방출 판독 간격 사이에 상태 전환이 발생하면 신호는 동일한 측정 창에 있는 두 부분의 평균이 되며, 이는 상태 식별 정확도와 최종 속도 상수 분석에 영향을 미칩니다.이는 측정 주파수가 전이율보다 훨씬 빠를 때 문제가 되지 않지만 서로 접근하면 문제가 됩니다(오른쪽 그림).시뮬레이션된 smFRET 궤적에 카메라의 흐림 효과를 반영하기 위해서는 데이터 수집 시간보다 더 높은 시간 분해능(예: 10배 빠른)으로 데이터를 시뮬레이션한 후 최종 궤적에 데이터를 저장해야 합니다.더 빠른 시간 분해능으로 smFRET 시간 궤적을 시뮬레이션한 [10]후 측정 시간 분해능(통합 시간)까지 빈으로 이동하여 카메라의 흔들림 효과를 시뮬레이션하는 MATLAB 코드 예는 GitHub(postFRET)를 참조하십시오.

포토링크 및 포토블레이팅

시간 궤적은 또한 두 염료의 광연결 및 광 표백 정보를 포함합니다.이 정보는 삭제해야 하며, 이로 인해 FLET 정보가 손실되는 시간 궤적에 공백이 발생합니다.광연결 및 광표백 정보는 측정에서 선택한 광연결 간격과 광표백 수명이 비교적 긴 일반적인 염료 시스템에 대해 제거할 수 있습니다.따라서 데이터 분석의 문제가 줄어듭니다.단, 점멸 간격이 짧거나 어두운 상태의 수명이 긴 염료를 사용하면 큰 문제가 됩니다.산소 스캐빈저 용액 또는 트리플렛 상태 담금질자와 같은 이 두 가지 문제를 완화하기 위해 특정 화학 솔루션이 개발되었습니다.

상태 식별 알고리즘

임계값화 방법, 숨겨진 마르코프 모델(HMM) 방법, 전환점 식별 방법 등 데이터를 분석하기 위한 여러 데이터 분석 방법이 개발되었습니다.임계값 처리 방식은 단순히 smFRET 궤적상의 인접한 두 상태 간에 임계값을 설정합니다.임계값을 초과하는 FLET 값은 상태에 속하고 다음 값은 다른 상태에 속합니다.이 방법은 신호 대 노이즈 비율이 매우 높은 데이터에 대해 작동하므로 구별 가능한 FLET 상태를 가집니다.이 방법은 직관적이고 오랜 기간 동안 응용되어 왔습니다.소스 코드의 예는 소프트웨어 [10]postFRET에서 찾을 수 있습니다.HMM은 각 상태 할당의 확률 함수를 통계적으로 계산하는 알고리즘, 즉 가능성이 낮은 할당에 패널티를 추가하는 알고리즘을 기반으로 한다.일반적인 오픈소스 코드 소프트웨어 패키지는 HaMMy, vBFRET, ebFRET, SMART, SMACKs, MASH-FRET [11][12][13]등 온라인으로 입수할 수 있습니다.전환점 분석 또는 변경점 분석(CPA)은 알고리즘을 사용하여 통계 분석을 사용하여 시간 궤적에 걸쳐 언제 전환이 발생하는지 식별합니다.예를 들어, 피셔 정보 이론과 Student's t-test 방법(STASI, 오픈 소스, GitHub 링크)에 기초한 CPA는 최적의 상태 수(즉, 노이즈 패널티와 총 상태 수)를 선택하여 상태 전이를 식별하고 설명 길이를 최소화한다.

환율 분석

일단 상태가 식별되면, 그러한 상태를 사용하여 상태 간의 쾨르스터 공명 에너지 전달 거리와 전이 속도 상수를 계산할 수 있다.상태 간의 병렬 반응 행렬의 경우, 각 전환의 속도 상수는 각 전환의 평균 수명으로부터 추출될 수 없으며, 이는 속도 상수의 역합으로 고정된다.한 상태에서 다른 모든 상태로의 전환 수명은 단일 분자에 대해 모두 동일합니다.그러나 속도 상수는 확률 함수, 즉 각 전환이 [15]이전된 상태의 총 시간에 걸친 각 전환의 수로부터 계산할 수 있습니다.

예를 들어 각 전이의 궤적 및 드웰 시간 히스토그램이 식별된 상태를 나타냅니다.라이프 타임은 모든 드웰 타임의 평균입니다.이것은, 그 상태의 모든 레이트 상수의 합계의 역수입니다.

여기서 i는 초기 상태, f는 전환의 최종 상태, N은 시간 궤적에서 이 전환의 수, n은 총 상태 수, k는 속도 상수, t는 전환이 발생하기 전 각 상태의 시간입니다.예를 들어, smFRET 시간 궤적의 130초(s)를 측정합니다.분자가 상태 1에 머무는 총 시간은1 t = 100초, 상태 2 t2 = 20초, 상태 3은 t = 10초이다3.100초 동안 분자가 상태 1에 머무르는 동안, 분자는 두 개의 상태로 70회 이동하며, 체류 시간이 끝날 때 세 개의 상태로 30회 이동한다. 따라서12 상태 1에서 상태 2로의 속도 상수는 k = 70/100 = 0−1.7초이며, 상태 1에서 상태 3으로의 속도 상수는13 k = 30/100 = 0−1.3초이다.일반적으로 70회 또는 30회 전이(드웰 시간) 길이의 확률은 기하급수적으로 분포됩니다(오른쪽 그림).상태 1의 두 분포, 즉 두 수명, θ와 θ의1213 평균 체류 시간은 이 두 전환에 대해 모두 1초에서 동일합니다(오른쪽 그림).전환 수 N은 총 상태 전환 수 또는 상태 드웰 시간 누적 히스토그램의 지수 붕괴 함수의 적합 진폭일 수 있습니다.후자는 올바르게 동작하는 드웰 타임 분포에서만 작동합니다.1차 반응에서 각 상태와 평형 상태에 있는 시스템은 이해하기 쉬운 특수한 경우이다.시스템이 평형 상태에 있지 않을 경우 이 방정식은 여전히 유지되지만 이를 사용하기 위해 주의를 기울여야 한다.

1개월 정기구독자 배지t.따라서 상태 n에서 분자의 "증가"는n c = tn / δt이다.이 모든 "변환율" 중에서, 이 측정 시간 δt 동안 N이 상태 f로 전달되면nf, 정의상 전달 속도는 r = Nnf / δt = knf c이다n.따라서nf k = Nnf/t입니다n.

속도 상수의 단일 분자 측정은 통계적으로 충분한 수의 단일 분자가 측정되고 체류 시간의 예상 양호한 행동 분포가 관찰되면 판단할 수 있는 에르고드 가설에만 의존함을 알 수 있다.각 분자가 구별 가능한 상태 집합 또는 속도 상수 집합을 갖는 경우 단일 분자 간의 이질성도 관찰될 수 있다.

불확실성 수준을 낮추다

속도 분석의 불확실성 수준은 여러 실험 시험, 부트스트랩 분석 및 적합 오류 분석을 통해 추정할 수 있습니다.상태 오할당은 데이터 분석 중에 자주 발생하는 오류 발생원으로, 상태 확대, 노이즈 및 카메라 흐림에서 발생합니다.데이터 비닝, 이동 평균 및 웨이브릿 변환은 상태 확대 및 노이즈의 영향을 줄이는 데 도움이 되지만 카메라의 흐림 효과를 향상시킵니다.

카메라의 흔들림 효과는 보다 민감한 카메라의 개발이나 특수 데이터 분석 또는 둘 다에 의존하는 빠른 샘플링 빈도로 줄일 수 있습니다.기존 HMM에서는 이행 전후의 데이터 포인트가 특별히 할당되어 이행 중 상태에 대한 이들 데이터 포인트의 잘못된 할당률을 낮춥니다.다만, 이 방법이 기능하는 데는 제한이 있습니다.전이 주파수가 샘플링 주파수에 가까워지면 너무 많은 데이터가 흐려져 이 방법이 작동하지 않습니다(카메라 흐림 그림 위 참조).펄스 레이저를 이용한 실험적인 접근법은 매우 빠른 [16]카메라 없이도 카메라의 흔들림 효과를 부분적으로 극복하는 것으로 보고되었다.아이디어는 각 카메라 수집 사이클에서 매우 짧은 기간만 조명하여 각 사이클에서 신호의 평균화를 방지하는 것입니다.

카메라의 흐릿한 데이터의 분석 정확도를 높이기 위한 2단계 데이터 분석 방법도 보고되었다.아이디어는 몬테카를로 시뮬레이션 방법으로 궤적을 시뮬레이션하고 그것을 실험 데이터와 비교하는 것이다.적절한 조건에서 시뮬레이션과 실험 데이터 모두 동일한 수준의 정보와 노이즈를 포함합니다.이 시뮬레이션된 궤적은 기초 사실이 "알려진" 것이기 때문에 원시 실험 데이터보다 더 나은 답이다.이 메서드에는 postFRET(GitHub 링크) 및 MASH-FRET으로 [12]사용할 수 있는 오픈소스 코드가 있습니다.이 방법은 또한 통계적 방법을 사용하여 상태를 정확하게 식별하는데 문제를 일으킨 비-가우스 소음의 영향을 약간 수정할 수 있다.

현재 smFRET에 대한 데이터 분석에서는 여전히 데이터 분석에서 노동력을 해방하는 역할을 하기 위해 딥러닝 알고리즘이 필요한 세심한 주의와 특별한 훈련이 필요합니다.

smFRET의 장점

3가지 상태(1-3)를 가진 시스템의 벌크(주황색), 앙상블 FLET(검은색) 및 smFRET 측정의 개략도 결과 비교.벌크 측정은 모든 상태를 추가하고 smFRET은 시간 경과에 따른 각 상태의 분자 수를 세어 해결합니다.운동 정보는 벌크 및 앙상블 측정에서는 숨겨지지만, 시간에 따른 각 상태 간의 변화를 분석하여 smFRET 측정에서는 관찰할 수 있습니다.


SmFRET은 이질적인 모집단을 보다 정밀하게 분석할 수 있으며 앙상블 FLET에 비해 몇 가지 장점이 있다.

단일 분자의 거리를 연구하는 것의 한 가지 이점은 앙상블에 기초한 평균을 계산하는 것보다 각 분자에 특정한 값으로 이질적인 모집단을 더 정확하게 연구할 수 있다는 것이다.이를 통해 이질적인 모집단 내에서 특정 균질 모집단을 연구할 수 있다.예를 들어, 이기종 모집단 내의 두 개의 기존 상동 모집단이 서로 다른 FLET 값을 갖는 경우, 앙상블 FLET 분석은 모집단 전체를 나타내기 위해 가중 평균 FLET 값을 생성한다.따라서, 얻어진 FLET 값은 두 개의 다른 모집단에 대한 데이터를 생성하지 않는다.반대로, smFRET은 두 모집단을 구별할 수 있고 기존의 상동 [18]모집단을 분석할 수 있다.

또한 SmFRET은 앙상블 FLET 측정을 통해 달성할 수 없는 개별 분자의 동적 시간 분해능을 제공한다.앙상블 FLET는 모집단에 축적되는 잘 채워진 전이 상태를 검출하는 기능은 있지만, 단명하고 축적되지 않는 중간 상태를 특징짓는 기능은 없다.이 한계는 축적에 관계없이 단일 분자의 중간을 관찰할 수 있는 직접적인 방법을 제공하는 smFRET에 의해 해결된다.분자에 대해 충분한 시간을 관찰하면, 소음이나 다른 상태의 확대와 구별할 수 있을 만큼 충분히 오래 지속되는 전이 상태의 이벤트가 발생할 것입니다.따라서, smFRET는 이기종 [19]환경에서 일시적인 하위 모집단을 포착할 수 있는 능력을 보여준다.

평형 상태에서의 시스템의 운동 정보는 시간에 따라 반응물과 생성물의 농도가 변화하지 않기 때문에 앙상블 수준에서 손실됩니다.그러나 단일 분자 수준에서 반응물과 생성물 간의 전달은 측정할 수 있는 높은 속도로 발생할 수 있으며 시간에 따라 확률적으로 균형을 이룰 수 있다.따라서 특정 분자의 시간 궤적을 추적하면 낮은 농도로 인해 앙상블 레벨에 숨겨진 중간체를 포함하여 각 전이 단계의 속도 상수를 직접 측정할 수 있습니다.이를 통해 smFRET을 사용하여 DNA, RNA 및 단백질의 접힘 역학을 연구할 수 있습니다.단백질 접힘과 유사하게, DNA와 RNA 접힘은 여러 상호작용, 접힘 경로, 그리고 중간을 거쳐 본래의 상태에 도달합니다.

또한 SmFRET은 앙상블 FRET보다 3색 시스템을 더 잘 활용하는 것으로 나타났습니다.하나의 수용체 형광체를 사용하는 대신 두 개의 수용체를 사용하여 FRET는 복잡한 분자의 상관된 움직임과 공간적 변화에 대해 여러 개의 부위를 관찰할 수 있다.이것은 홀리데이 분기점에 대한 연구에서 알 수 있다.3색 시스템을 갖춘 SmFRET은 접합부의 3개의 나선 부위의 동기화된 움직임과 병렬 상태의 거의 존재하지 않는 상태에 대한 통찰력을 제공한다.앙상블 FLET은 3색 시스템도 사용할 수 있습니다.단, 형광체 신호의 명확한 분리를 포함한 3색 시스템의 요구사항은 명백한 이점보다 더 중요합니다.신호의 명확한 구별을 위해 FLET 오버랩은 작아야 하지만 FLET 강도가 약해집니다.SmFRET은 밴드 패스 필터와 다이크로익 미러를 사용하여 오버랩 한계를 수정하여 두 개의 형광 리셉터 사이의 신호를 강화하고 블리딩 스루 [20]효과를 해결합니다.

적용들

smFRET의 주요 용도는 단백질 접힘을 촉진하는 미세한 생화학 뉘앙스를 분석하는 것이다.최근 몇 년 동안 단백질 접힘과 전개에 관여하는 단일 분자 상호작용을 조사하기 위해 여러 기술이 개발되었습니다.원자력 현미경과 레이저 핀셋을 이용한 힘-프로브 기술은 단백질 안정성에 대한 정보를 제공해 왔다. smFRET은 연구자들이 형광을 이용하여 분자 상호작용을 조사할 수 있게 해준다.FRET(Forster resonance energy transfer)는 Ha 등에 의해 단일 분자에 처음 적용되었고 Hochstrasser, Weiss 등에 의해 작업 중인 단백질 접힘에 적용되었다.smFRET이 분자 상호작용을 분석하는 데 전체적으로 제공하는 이점은 데이터의 앙상블을 평균화할 필요 없이 단일 분자 상호작용을 직접 테스트할 수 있는 능력입니다.단백질 접힘 분석에서 앙상블 실험은 접힘 상태와 펴짐 상태 사이의 다양한 전환 상태에 있는 여러 단백질의 측정을 포함한다.평균화할 때, 데이터의 앙상블에서 추론할 수 있는 단백질 구조는 단백질 접힘의 기본적인 구조 모델만 제공한다.그러나 단백질 접힘에 대한 진정한 이해를 위해서는 접힘 상태와 펴짐 상태 사이의 접힘 경로를 따라 구조적 사건의 시퀀스를 해독해야 한다.smFRET이 매우 적용 가능한 것은 이 연구의 특정 분야입니다.

FLET 연구는 단백질 접힘 현상을 시간 분해 관찰한 결과로 해당 FLET 효율성을 계산합니다.이러한 FLET 효율성은 시간 대비 함수로서 분자 사이의 거리를 추론하는 데 사용될 수 있다.접힌 상태와 펴진 상태 사이의 단백질 전환에 따라, 분자 사이의 상응하는 거리는 단백질 [21]접힘을 이끄는 분자 상호작용의 순서를 나타낼 수 있습니다.

smFRET의 또 다른 적용은 DNA와 RNA 폴딩 [22]다이내믹스입니다.전형적으로, 뉴클레오티드의 두 다른 위치는 기증자와 수용체 염료로 라벨링된다.두 위치 사이의 거리 변화는 뉴클레오티드의 접힘과 전개에 따라 시간에 따라 각 측정 창과 다른 창 사이의 두 지점의 무작위 확산에 따라 변화한다.접힘/접힘 궤적이 복잡하기 때문에 앙상블 수준에서 공정을 측정하기가 매우 어렵습니다.따라서 smFRET은 이 분야에서 중요한 기술이 됩니다.smFRET 데이터 분석의 과제 외에도, 한 가지 과제는 여러 관심 위치에 레이블을 붙이는 것이고, 또 다른 과제는 전체 접힘 경로를 계산하기 위한 두 지점 역학이다.

또한 단일 분자 FLET는 특정 채널에서 관련 채널 모티브의 구조 변화를 연구하기 위해 적용될 수 있다.예를 들어, 라벨이 부착된 4중합체 KirBac 칼륨 채널은 지질막 내 구조역학을 이해하기 위해 특정 부위에 공여체 및 수용체 불소체로 라벨이 부착되어 있어 다른 진핵생물 Kir 채널 또는 일반적인 양이온 채널에서 유사한 모티브에 대한 유사한 역학을 일반화할 수 있었다.이 실험에서 smFRET을 사용하면 거시적 측정치가 단순히 평균화될 경우 볼 수 없는 입체구조 변화를 시각화할 수 있다.이것은 개별 분자의 분석과 그 안의 구조 변화보다는 앙상블 분석으로 이어질 것이고, 다른 진핵생물 채널에서 유사한 모티브에 대한 유사한 역학을 일반화할 수 있게 할 것이다.

KirBac 채널의 구조적 역학은 리간드 PIP2의 존재에 따라 개방 및 폐쇄 상태에서 철저히 분석되었다.smFRET에 기초한 결과의 일부는 세포 외 영역의 구조적 강성을 보여주었다.선택성 필터와 선택성 필터 영역의 외부 루프는 형광체로 라벨이 부착되어 있으며 입체구조 결합이 관찰되었습니다.개별 smFRET 궤적은 [23]채널 상태에 관계없이 변동 없이 약 0.8의 FLET 효율성을 강하게 보여주었습니다.

최근에는 표적 DNA를 정량적으로 검출하고 단일 뉴클레오티드 다형을 구별하기 위해 단일 분자 FLET가 적용되고 있다.앙상블 FLET와 달리 싱글 분자 FLET은 타깃 바인딩 이벤트를 실시간으로 감시할 수 있습니다.또한 단일 분자 FLET 기술로 관찰된 낮은 백그라운드, 높은 신호 대 잡음비는 초감도(펨토몰 범위의 감지 한계)로 이어집니다.최근에는 검출 한계를 낮추기 위해 다양한 유형의 신호 증폭 단계가 포함되어 있습니다.

제한 사항

대략적인 추정치에도 불구하고, smFRET의 한계는 에너지 전달과 관련된 정확한 거리를 얻기 어렵다는 것이다.에너지 전달뿐만 아니라 공여체와 수용체 형광체의 형광은 환경 및 염료 배향 방법에 따라 달라지기 때문에 정확한 거리 추정을 요구하는 것은 중요한 과제가 된다. 형광체가 결합되어 있는 위치의 유연성에 따라 달라질 수 있다.그러나 두 형광체의 거리 추정이 정확하고 절대적인 [6]정밀도로 결정될 필요가 없는 경우에는 이 문제가 특별히 관련이 없다.

약 수 밀리초 이하의 전이율로 복잡한 생물학적 시스템에서 운동 정보를 추출하는 것은 여전히 어려운 일이다.이러한 측정의 현재 시간 분해능은 일반적으로 밀리초 수준이며 몇 가지 보고서는 마이크로초 수준입니다.염료 광물리학에는 이론적인 한계가 있다.전형적인 유기 염료 분자의 들뜬 상태의 수명은 약 1나노초입니다.FLET 값의 통계적 신뢰도를 얻으려면 수십~수백 개의 광자가 필요하며, 이를 통해 가능한 최고의 시간 분해능을 1마이크로초 정도로 할 수 있다.이 한계에 도달하기 위해서는 매우 강한 빛(1×10Wm의10−2 전력 밀도, 일반적으로7 현미경을 사용하여 레이저 빔을 집중시킴으로써 얻을 수 있는 10개의 태양)이 필요하며, 이는 종종 유기 분자에 광손상을 일으킨다.또 다른 한계는 빛의 강도와 환경의 산화/환원 응력의 함수인 염료의 광 표백 수명입니다.일반적인 실험 조건(레이저 전력 밀도 불과 몇 개 태양)에서 일반적인 유기 염료의 광 표백 수명은 산소 스캐빈저 용액의 도움으로 몇 초 또는 몇 분 안에 완료됩니다.따라서 몇 분보다 긴 운동학적 현상은 유기 염료로 조사하기 어렵다.양자 도트, 폴리머 도트, 전유기 염료와 같이 수명이 긴 다른 탐침은 유기 염료 대신 사용해야 한다.

레퍼런스

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